幾種蔬菜ACC氧化酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文幾種蔬菜ACC氧化酶基因的克隆與鑒定姓名：陳銀華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：葉志彪20050501華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2004屆博I。學(xué)位論文：蔬菜ACC軾化酶捧㈥的克降’o燎定4構(gòu)建了上叫c0，，基因cDNA序列的正義、反義、RNAi載體、兩個(gè)不同長度啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體共5個(gè)。并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將它們成功導(dǎo)入番茄“中蔬5號”中。對轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析表明，外源基因的導(dǎo)入改變了內(nèi)源基因的表達(dá)。5

2、為研究LeACOll基因上游調(diào)控元件，對兩個(gè)不同長度啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)的uidA(GUS)基因表達(dá)進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)基因植株組織化學(xué)分析表明，長度為1200bp和2000bp都只能在果實(shí)中指導(dǎo)uidA的表達(dá)。2000bp的片段能自主驅(qū)動(dòng)uidA基因的特異表達(dá)，并且隨著成熟度的加深表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。1200bp的片段在干旱和傷害因子的誘導(dǎo)下，能驅(qū)動(dòng)uidA的特異表達(dá)。6從黃瓜基因組中克隆了ACC氧化酶基因CsAC04，其GenBank登錄號為AY45

3、0356?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，CsAC04基因全長2200bp，有4個(gè)外顯子序列，3個(gè)內(nèi)含予序列，上游序列非編碼區(qū)長784bp，外顯子全長936bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基。以推斷的轉(zhuǎn)錄起始位NNI，5l—11為啟動(dòng)子的核心區(qū)，47—39為TATA盒結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)cAAT盒結(jié)構(gòu)。在TATA盒上游有九個(gè)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的前導(dǎo)響應(yīng)元件。7以雌性系、雄性系、雌雄同株3個(gè)不同的性別表現(xiàn)型植株為材料，研究了CsAC04基因在各組織的表達(dá)差異。該基因在

4、雌性系、雌雄同株2個(gè)性別表現(xiàn)型的雌性花中表達(dá)，而果實(shí)、葉片中沒有表達(dá)；在雄性系植株的各組織均不表達(dá)。8進(jìn)一步構(gòu)建了CsAC04基因的RNAi植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化黃瓜“滓研4號”，獲得轉(zhuǎn)基因植株5棵。轉(zhuǎn)基因植株田間表型觀察表明，CsAC04基因抑制了內(nèi)源ACO基因的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株在第20節(jié)位以內(nèi)只表現(xiàn)雄花分化。9從花椰菜基因組中克隆了ACC氧化酶基因BoACO，其登錄號為AY676466。測序結(jié)果表明，所克隆

5、片段全長1202bp，包含3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子，去除內(nèi)含子后丌放閱讀框架(ORF)長756bp，編碼252個(gè)氨基酸。10對花椰菜植株不同組織器官(根、莖、葉、花)的Northern雜交分析顯示，BoACO基因在葉片和花中表達(dá)，而在根、莖中不表達(dá)，花中的表達(dá)量大于葉片中。11構(gòu)建了BoACO的RNAi植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法對花椰菜“南苜t60”進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，Southern雜交結(jié)果表明，其中3株花椰菜基因組中導(dǎo)入了