VP2互作蛋白CK1α及CSGalNAcT2在雞傳染性法氏囊病病毒復制中的作用及分子機制研究.pdf

1、傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害3-6周齡雛雞的中樞免疫器官—法氏囊，有人形象地稱該病為雞的―艾滋病。隨著IBDV的不斷進化變異，先后出現(xiàn)了經(jīng)典毒株（classic IBDV,cIBDV）、變異毒株(variant IBDV,vIBDV)以及超強毒株(ve

2、ry virulent IBDV,vvIBDV)，vvIBDV的高致死率給世界養(yǎng)禽業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟損失。近年來，在流行病學研究不斷深入及反向遺傳學技術日趨成熟的基礎上，作為IBDV外層衣殼唯一組成成分的VP2蛋白，已被確認為是決定病毒毒力及細胞嗜性差異的重要分子基礎。然而IBD發(fā)生與發(fā)展的實質是IBDV與宿主細胞相互博弈的過程。盡管在病毒層面已表明VP2蛋白對IBDV的細胞嗜性和毒力有重要影響，然而VP2蛋白在宿主細胞內(nèi)的具體作用依然還

3、不清楚。因此，深入了解VP2蛋白與宿主細胞的相互作用已成為目前揭開IBDV致病和免疫機制的研究重點。
　　本研究從病毒與宿主相互作用的角度，采用不同的蛋白相互作用技術，以VP2蛋白為誘餌篩選出與其相互作用的宿主蛋白，并進一步探索它們在IBDV復制過程中的分子作用機制。首先，以免疫共沉淀技術與質譜技術相結合，在感染IBDV的易感細胞DF1中，利用VP2蛋白的特異性單克隆抗體，鑒定出了一個互作候選蛋白酪蛋白激酶CK1α。免疫共沉淀及激

4、光共聚焦試驗進一步證實，CK1α與VP2在IBDV感染過程中存在相互作用。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)在IBDV復制過程中，CK1α呈下調(diào)表達。基因表達調(diào)控實驗表明，CK1α下調(diào)表達能夠抑制IBDV復制，反之則促進IBDV復制，另外CK1α激酶活性抑制劑D4476也會抑制IBDV復制，這表明CK1α對IBDV復制的影響與其激酶活性有關。綜上，CK1α在IBDV復制過程中的下調(diào)表達可能是宿主抵抗IBDV的一種抗病毒應答。為深入揭示宿主通過下調(diào)CK1

5、α來限制IBDV復制的分子機制，我們經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，IBDV感染能夠誘導產(chǎn)生IFN-β，而CK1α過表達能夠拮抗IFN-β的抗病毒效應，但這種拮抗作用不是源于對IFN-β本身表達量的負調(diào)控，而是源于對IFNAR1穩(wěn)定性的負調(diào)控。CK1α負調(diào)控IFNAR1穩(wěn)定性的具體機制是，CK1α能夠泛素化降解IFNAR1。IFNAR1的C端胞內(nèi)區(qū)存在一個保守的降解決定子序列，它與IFNAR1的泛素化密切相關，其磷酸化位點S545是CK1α發(fā)揮調(diào)控功能的

6、關鍵位點。點突變實驗證實，S545A的確能夠削弱CK1α介導的IFNAR1泛素化。IBDV感染宿主細胞的過程中，在發(fā)現(xiàn)CK1α下調(diào)的同時，也發(fā)現(xiàn)了IFNAR1在細胞膜表面上的分布增加。因此我們認為，CK1α作為宿主的一種感應分子，在IBDV感染后被下調(diào)，進而通過負調(diào)控機制導致IFNAR1的上調(diào)，從而增強宿主限制IBDV復制的能力。
　　在宿主的抗病毒壓力下，病毒也進化出多種機制來利用宿主細胞的資源而利于自身復制。本研究還鑒定了另一

7、個有利于 IBDV復制的宿主細胞蛋白—高爾基體膜蛋白硫酸軟骨素N-乙酰氨半乳糖胺基轉移酶（CSGalNAcT2）。CSGalNAcT2能夠與VP2蛋白在高爾基體上發(fā)生相互作用。結合基因芯片分析結果及熒光定量檢測結果，我們證實，CSGalNAcT2在IBDV感染過程中表達上調(diào)，而CSGalNAcT2上調(diào)表達能夠促進IBDV的復制，且此種促進作用依賴于高爾基體結構的完整性。高爾基體是IBDV“復制工廠”核糖核蛋白復合體（RNP）的所在地，V