魚類卵黃高磷蛋白衍生抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)功能的研究.pdf

1、在魚類對外界刺激及病原物侵襲的防御反應(yīng)中,非特異性免疫起著重要作用?？咕?AMPs)作為效應(yīng)分子在宿主防御抵御病原體中扮演一個重要的天然免疫中的作用,當(dāng)機體遇到病原體入侵時,以活體形式由相應(yīng)的細(xì)胞合成并釋放出來.發(fā)揮抗菌作用及其它生物學(xué)功能,在魚體與病原生物不斷抗?fàn)幍倪^程中起到固有防御的作用。抗菌肽除去具有抗菌功能,還普遍具有免疫調(diào)節(jié)功能。
　　本論文是以前發(fā)現(xiàn)的卵黃高磷蛋白Pv具有免疫防御作用的研究基礎(chǔ)上,特別是發(fā)現(xiàn)Pv截斷形

2、成的小分子也具有抗菌活性的基礎(chǔ)上,開展Pv免疫調(diào)節(jié)作用的研究。目前,已經(jīng)有大量關(guān)于抗菌肽在魚類的免疫防御中發(fā)揮功能的研究報道,但在免疫調(diào)節(jié)方面的作用及其機理的研究極其少見。我們從以下幾個方面探討了Pv衍生的抗菌活性肽Pt5在魚類對抗病原菌感染中的免疫功能及其機理:一、建立斑馬魚敗血癥模型通過腹腔注射重組表達(dá)的抗菌肽Pt5是否具有免疫保護和調(diào)節(jié)功能,二、通過分子生物學(xué)手段研究抗菌肽在斑馬魚受到病原菌侵害時,對斑馬魚體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和保護作用的

3、機理。
　　首先,在原核重組表達(dá)抗菌肽Pt5的過程中,利用近年來Studier等人提出的先進的外源基因自誘導(dǎo)表達(dá)策略無論在產(chǎn)出蛋白的質(zhì)量還是數(shù)量上都比傳統(tǒng)方法都有很大提高,克服了具有細(xì)胞毒性抗菌肽表達(dá)量小,多在包涵體中表達(dá)的不足,充分保留了融合蛋白的活性,為后續(xù)的內(nèi)體實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　其次,通過建立嗜水氣單胞菌A.hydrophila弓l起的斑馬魚敗血癥模型,研究了具有抗菌活性的蛋白小肽Pt5在急性細(xì)菌性魚類敗血癥中的生

4、物學(xué)功能。結(jié)果顯示急性細(xì)菌感染后,Pt5注射組斑馬魚的存活率較對照組和無活性的Pt5突變體M13注射組都顯著提高,并且顯著降低了組織器官的染菌數(shù)量,通過對斑馬魚外周血細(xì)胞的檢測,發(fā)現(xiàn)Pt5注射組能調(diào)節(jié)病原菌感染斑馬魚免疫細(xì)胞的變化,緩解宿主體內(nèi)強烈的炎癥反應(yīng),減輕斑馬魚病原菌感染的癥狀,對斑馬魚在急性病原菌感染中起到了保護性作用。
　　為明確Pt5在斑馬魚急性感染中的作用機制,通過熒光實時定量技術(shù),注射抗菌蛋白Pt5后,檢測斑馬魚

5、體內(nèi)免疫相關(guān)的促炎細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子在兩個重要免疫器官脾、頭腎組織中的表達(dá)變化。結(jié)果表明,外源菌感染的情況下,Pt5注射組在注射后6h和12h能顯著降低四種促炎癥因子基因il-lβ,il-6,tnf-a和ifn-γ表達(dá)量,而M13、注射組和PBS注射組在感染病原菌后,促炎癥細(xì)胞因子mRNA則大量表達(dá)。在對抗炎癥因子的表達(dá)影響中,Pt5注射12h后,Pt5能顯著提升抗炎癥因子基因il-10和il-4的表達(dá)量。
　　綜合以上實驗

6、結(jié)果,我們認(rèn)為大劑量的抗菌肽Pt5在斑馬魚細(xì)菌性感染過程中所起到的免疫調(diào)節(jié)和保護作用,可能是直接地殺死病原菌,而不是通過激活魚體內(nèi)炎癥反應(yīng)來抵抗病原菌的急性感染,在體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇的時候,能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機制,降低促炎癥反應(yīng)的效應(yīng)因子,并誘導(dǎo)抗炎癥反應(yīng)的效應(yīng)因子的產(chǎn)生,從而有效降低過度的炎癥反應(yīng),防止斑馬魚在急性細(xì)菌感染中產(chǎn)生的感染性休克癥狀,從而保護斑馬魚在原菌侵染中的生存率。
　　本實驗第一次揭示了魚類卵黃高磷蛋白Pv衍生抗菌