朱砂根細(xì)胞組織培養(yǎng)及其巖白菜素含量分析.pdf

1、朱砂根是著名的藥用花卉植物，其主要藥用成分為巖白菜素。本試驗以朱砂根的愈傷組織為材料，進(jìn)行如下研究：①朱砂根愈傷組織的生長和分化的影響因素的研究；②朱砂根愈傷組織巖白菜素提取工藝的優(yōu)化和巖白菜素含量HPLC測定方法的建立；⑨朱砂根懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及其細(xì)胞培養(yǎng)過程中的動力學(xué)研究；④朱砂根懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長與巖白菜素含量的關(guān)系研究。主要研究結(jié)果如下： 1朱砂根愈傷組織生長與分化的研究 試驗比較了不同培養(yǎng)基類型、不同碳源

2、及其濃度、不同氮源、植物生長調(diào)節(jié)劑、不同光照強度、不同光質(zhì)及添加物水楊酸對朱砂根愈傷組織繼代、增殖與保持的影響。結(jié)果表明：MS+0.5mg·L-12，4-D是朱砂根愈傷組織繼代、增殖與保持的最佳培養(yǎng)基；最佳碳源為25 g·L-1蔗糖；最佳氮源為1900 g·L-1 KNO3；最佳培養(yǎng)條件為遮光培養(yǎng)；水楊酸的最佳添加濃度為10-5 mg·L-1，最佳添加時間為第20d。 在MS+0.05 mg·L-12，4-D+2.0 mg·L-

3、1 KT+100 mg·L-1肌醇+4％蔗糖+3％甘露醇+5％椰汁培養(yǎng)基中根分化率最高，歷時也較長；在同等條件下，激素對朱砂根愈傷組織分化根的影響效果為KT>6-BA>NAA；1/2 MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更易促進(jìn)朱砂根愈傷組織中根的分化。 2朱砂根愈傷組織中巖白菜素的提取工藝、測定及含量研究 本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取提取溫度、提取時間、水料比這3個因素進(jìn)行二次回歸正交組合設(shè)計試驗(響應(yīng)面分析法)，利用響應(yīng)面法對其

4、提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，當(dāng)提取時間為49.7411 min，提取溫度為80.0846℃，料液比為1：9.9966時，巖白菜素濃度達(dá)到最大為81.3388 ug·mL-1。 測定方法：HPLC的流動相為甲醇：水=20：80(梯度洗脫)，檢測波長為275 nm。 試驗比較了不同培養(yǎng)基類型、不同碳源、不同氮源、植物生長調(diào)節(jié)劑、不同光照強度、不同光質(zhì)及添加物水楊酸對朱砂根愈傷組織中巖白菜素含量的影響。結(jié)果表明：有利于

5、朱砂根愈傷組織中巖白菜素含量的積累的培養(yǎng)基為4 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT；0.5 g·L-1水解酪蛋白可以提高巖白菜素的含量；最佳氮源為1650 mg·L-1 NH4NO3；最佳光照為遮光培養(yǎng)；綠光可提高巖白菜素的含量；培養(yǎng)第20 d添加10-4 mg·L-1水楊酸可提高巖白菜素的含量。 3朱砂根懸浮細(xì)胞系的建立及培養(yǎng)過程中的動力學(xué)研究 本試驗將顆粒性強的的愈傷組織

6、進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，研究了基本培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件、接種量，細(xì)胞濃度及碳源對朱砂根細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞生長和巖白菜素含量的影響；測定了朱砂根細(xì)胞生長和巖白菜素積累的動態(tài)變化，并對懸浮培養(yǎng)的理化特性和動力學(xué)做了初步的研究。結(jié)果表明：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在MS培養(yǎng)基中生長良好，細(xì)胞分散性較好；最佳激素組合為0.5 mg·L-12，4-D+0.05mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA；細(xì)胞繼代周期以8 d左右為宜；懸浮細(xì)胞適合在23℃-25℃、11

7、0 rpm下生長；最佳碳源為蔗糖15 g·L-1添加0.03 g·L-1Ad；最佳接種密度為0.0714 g·mL-1。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在第3-7 d為對數(shù)生長期，細(xì)胞干重至第7 d達(dá)到最大。在細(xì)胞對數(shù)生長期內(nèi)，巖白菜素積累與細(xì)胞生長呈線形正相關(guān)性，第7 d巖白菜素含量達(dá)到最大值0.0148％。朱砂根懸浮培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)(如氮源、磷源和碳源)的消耗與生物量的積累和巖白菜素的生物合成呈一定的相關(guān)性。 試驗建立了朱砂根細(xì)胞生長

8、、蔗糖消耗、巖白菜素合成的動力學(xué)方程：細(xì)胞生長：μ=μm1/1+Ks/Cs+Cs/K1底物消耗：qs=μ1/YX/S+m+1/YP/Sqp產(chǎn)物合成：qp=aμ+β 上式中，μ代表比生長速率，μm代表最大比生長速率，KS代表底物飽和常數(shù)，KI代表底物抑制常數(shù)，Cs代表底物濃度，qs代表底物的比消耗速率，YX/S代表為底物消耗對細(xì)胞的得率系數(shù)，m代表細(xì)胞的維持系數(shù)，YP/S代表產(chǎn)物對底物消耗的得率系數(shù)，qp代表產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率，α，

9、β代表比例系數(shù)。 經(jīng)過驗證，模型預(yù)測值與試驗結(jié)果有較高的擬合度，說明模型具有一定的合理性、可信度。 4朱砂根懸浮細(xì)胞生長與巖白菜素含量關(guān)系研究 在MS基本培養(yǎng)基中，60 mM的硝態(tài)氮而去掉氨態(tài)氮，朱砂根懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長最快；而當(dāng)氨態(tài)氮與硝態(tài)氮的摩爾濃度比為5：1，總氮源為40 mM時，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞巖白菜素的生物合成能力最強。采用氮源改變調(diào)節(jié)的二步培養(yǎng)可使細(xì)胞的生物量和巖白菜素含量分別達(dá)到0.3498 g和0.0

10、478％，分別為對照的3.11倍和3.57倍。 磷酸鹽濃度為1.1 mM時，即為MS基本培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度時，細(xì)胞生長量達(dá)到最高為0.1851 g，巖白菜素的含量也達(dá)到最大為0.0239％；Mn2+，Zn2+，BO33+，I-，MoO42-，Cu2+，Co2+，F(xiàn)e2+這8種元素中I-，MoO42-，Cu2+，Co2+對巖白菜素的合成影響較大，I-濃度提升到5倍，MoO42-濃度提升10倍，Cu2+濃度提升10倍，Co2+濃度提