紅麻CMS系P3A及其保持系P3B花藥線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility, CMS)是高等植物中普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象，關(guān)于CMS發(fā)生的分子機(jī)理，目前還不是很清楚。很多研究認(rèn)為線粒體是CMS的載體，而蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，因此，開(kāi)展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于揭示細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理具有重要意義。本研究以紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P3A及其保持系P3B為材料，運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)其雙核期花藥線粒體蛋白質(zhì)組展開(kāi)研究，對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2、并針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果對(duì)atp1基因的保守區(qū)進(jìn)行克隆，獲得了如下結(jié)果:
　　 1.運(yùn)用IEF/SDS-PAGE雙向凝膠電泳技術(shù)，獲得了紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P3A及其保持系P3B花藥線粒體蛋白質(zhì)的清晰凝膠電泳圖譜，在分子量17-130KDa、等電點(diǎn)3-10范圍內(nèi)，大約可以識(shí)別1000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，利用ImageMaster2D platinum5.0軟件分析結(jié)果表明:不育系和保持系線粒體蛋白質(zhì)之間存在50個(gè)差異點(diǎn)。其中僅在不育系中特

3、異表達(dá)的點(diǎn)7個(gè)，僅在保持系中特異表達(dá)的點(diǎn)4個(gè)，其他39個(gè)為量的差異，其中在不育系中上調(diào)表達(dá)的點(diǎn)23個(gè)，在保持系中上調(diào)表達(dá)的點(diǎn)16個(gè)。
　　 2.對(duì)50個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)采用基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行肽指紋圖譜分析(MADIL-TOF-TOF-MS)，獲得了28個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽指紋圖譜，并用Mascot軟件在NCBInr綠色植物數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，成功鑒定出24個(gè)蛋白質(zhì)，分別為V-ATP酶B亞基，微管蛋白β-18，微管蛋白α-4

4、，ATP合成酶α亞基，線粒體外膜蛋白，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被鑒定為同一蛋白ATP合成酶F1亞基1，ATP合成酶β亞基，線粒體伴侶蛋白CPN60，過(guò)氧化物酶B，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白2，磷酸甘油酸變位酶，琥珀酸脫氫酶，2個(gè)線粒體多肽加工酶β亞基，線粒體多肽加工酶α亞基，蘋果酸脫氫酶，成熟酶K，半胱氨酸富集分泌蛋白38，3個(gè)假定蛋白和1個(gè)預(yù)測(cè)蛋白。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)主要涉及到能量代謝等過(guò)程，很可能與紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生有關(guān)。
　　 3.采用同源克隆的

5、方法，根據(jù)Genbank里其它物種的atp1基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR擴(kuò)增獲得了紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P3A及其保持系P3B的atp1基因1045bp序列。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩者之間的差異不大，只有7個(gè)堿基不同，分別為P3A在第3位處由A→G，第58、616、1002位由C→T，第685位由T→C，第786、971位由G→A;而P3B則在第21位處缺失了1個(gè)堿基C和在1010位處缺失了1個(gè)堿基G，同源性達(dá)到99.14％。半定量RT-PC