紅麻光鈍感突變體的基因組差異與蛋白質組學研究.pdf

1、紅麻(Hibiscus cannabinus L.)為錦葵科木槿屬短日照一年生草本韌皮纖維植物,具有耐環(huán)境脅迫能力強、適應性廣、纖維產量高、品質好等特性,是我國麻紡和造紙工業(yè)的重要纖維原料,但其早花混雜品種嚴重影響了纖維產量,本研究擬以福紅952航天誘變獲得的光鈍感(對光周期反應不敏感)突變體為材料,在海南表現(xiàn)為三種類型的突變體:現(xiàn)蕾期幼蕾脫落(GⅠ型)、現(xiàn)蕾不開花(GⅡ型)、開花不結實(GⅢ型),分別從植物生理學、基因組差異、蛋白質組

2、學研究突變體光鈍感且短光誘導不育的遺傳規(guī)律。研究結果如下：
　　 ⑴紅麻光周期觀察:紅麻光鈍感突變體2008年冬季在海南自然短日照條件下,155d仍未現(xiàn)蕾開花,而正常品種只需120d左右即可現(xiàn)蕾開花。2009年7月4日在福州對紅麻光鈍感突變體材料進行12h的短日照處理,結果表明處理20d后對照福紅952開始現(xiàn)蕾,而突變體30d后開始現(xiàn)蕾,即現(xiàn)蕾時間推遲大約10d左右。
　　 ⑵以紅麻品種福紅952經航天誘變獲得的光鈍感突

3、變體與光敏感紅麻細胞質保持系L23B品種雜交,在海南130d短日照條件下誘導了花蕾的分化發(fā)育,即突變體中出現(xiàn)了幼蕾的黃化脫落、現(xiàn)蕾不開花、開花不結實三種類型,觀察其分離情況,F2代群體光敏感與光鈍感植株的分離比例為3:1分離,說明光鈍感與光敏感性狀存在一對基因的遺傳差異,光周期鈍感性狀為隱性遺傳,該研究結果可為進一步開展紅麻光鈍感的基因克隆及分子機理研究提供重要的遺傳材料。
　　 ⑶分別測定在人工短日照光周期處理的光鈍感紅麻與對

4、照福紅952三個不同時期的葉片可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸含量的動態(tài)變化,結果表明,隨著紅麻從一裂葉、三裂葉、五裂葉三個不同時期的發(fā)育,葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性氨基酸均呈現(xiàn)低、高、低的變化規(guī)律,對照福紅952變化幅度均大于光鈍感植株,表明紅麻光鈍感在光周期誘導下表現(xiàn)出的光周期不敏感特性與其葉片內的生理代謝密切相關。
　　 ⑷從24個多態(tài)性較好的RAPD引物中篩選到3個引物可以把紅麻光鈍感突變體與對照品種區(qū)分開來

5、,獲得4條特異條帶,測序表明這四個片段大小分別為612bp、723bp、743bp、1178bp,為進一步開發(fā)SCAR標記奠定實驗基礎。
　　 ⑸應用在其他高等植物開發(fā)的8對mtDNA(線粒體DNA)特異引物,對紅麻光鈍感突變體線粒體基因非編碼區(qū)DNA序列進行PCR擴增。結果表明選用的8對引物能擴增線粒體基因間隔區(qū)和內含子區(qū)域,并只檢測到2個變異位點,說明mtDNA在紅麻光鈍感突變體與親本之間相當保守。
　　 ⑹應用8對

6、cpDNA(葉綠體DNA)通用引物對紅麻光鈍感突變體及相近的紅麻品種的葉綠體基因組非編碼區(qū)DNA序列進行PCR擴增。共擴增植物cpDNA約13kb,占其葉綠體基因組8.1％。擴增產物分別應用4種限制性內切酶(EcoRⅠ HindⅢ、TaqⅠAulⅠ)酶切,1.5％瓊脂糖電泳檢測結果表明:cpDNA在紅麻光鈍感突變體與正常品種比較,均能擴增出條帶,大小在1.5kb-2.0Kb之間,說明所選用的通用引物可用于紅麻葉綠體基因組DNA研究,將P

7、CR擴增產物進行酶切,每個片段均有相同的酶切位點,僅cp4引物的PCR擴增產物用AluⅠ內切酶酶切得到多態(tài)片段,但突變體與親本之間未發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組DNA發(fā)生變異。上述結果表明,紅麻光鈍感突變發(fā)生在基因組DNA上,與線粒體與葉綠體的基因組DNA無關。
　　 ⑺以紅麻光周期不敏感(光鈍感)突變體的開花期與正常品種福紅952葉片為材料,首先建立并優(yōu)化蛋白質雙向電泳研究體系,即采用蛋白質雙向電泳(two-dimensional ele

8、ctrophoresis,2-DE)技術,在樣品制備、不同的蛋白質上樣量及染色方法等方面進行了比較研究,研究結果表明:(1)紅麻葉片TCA丙酮法比苯酚抽提法提取效率高且蛋白齊全,其中TCA-丙酮法蛋白提取率為20.56％,苯酚抽提法提取效率為4.90％。(2)蛋白質干粉的裂解液中加入0.2M硫脲后可以獲得更多的蛋白質差異點,這些差異點主要為堿性蛋白。(3)分別利用銀染和考馬斯亮藍染色對第二向SDS-PAGE膠進行染色,結果表明,銀染靈敏

9、度最高,但可重復性差,考馬斯亮藍G250比R250染色方法更靈敏,因此建議使用考馬斯亮藍G250,可以獲得理想的結果。(4)利用上述改良后的方法提取紅麻福紅952與光鈍感紅麻葉片總蛋白,進行雙向電泳,對染色后的膠體圖片利用PDQUEST軟件進一步對雙向電泳產生的2-DE蛋白質圖譜進行比較分析,獲得9個差異的蛋白質點,其中2個核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶,質體轉酮酶,果糖1,6-磷酸醛縮酶,熱激蛋白共5個點在品種福紅952中出現(xiàn),而在突變