紅麻CMS系和保持系能量代謝相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及RNAi載體的構(gòu)建.pdf

1、紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維經(jīng)濟(jì)作物,因其良好的纖維品質(zhì)得到廣泛應(yīng)用。紅麻具有極強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì),利用紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)培育紅麻雜交品種是雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑,因此,揭示紅麻CMS機(jī)理具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。
　　大量研究表明,花藥發(fā)育小孢子時(shí)期的能量供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致CMS發(fā)生。目前,在對(duì)紅麻CMS分子機(jī)制的研究中,有關(guān)能量代謝差異表達(dá)基因的研究主要集中于線粒體相關(guān)

2、基因,然而,植物體的能量代謝是核與質(zhì)相互協(xié)調(diào)的過(guò)程,因此研究不育系(P3A)和保持系(P3B)的核能量代謝差異表達(dá)基因?qū)α私釩MS植物體能量代謝的核與質(zhì)相互協(xié)調(diào)機(jī)理是非常有益的探索過(guò)程。本課題組的前期工作通過(guò)DNA芯片技術(shù)和紅麻花藥轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)證實(shí),戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶基因6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)和短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶基因(Alcohol de

3、hydrogenase,ADH1)在不育系和保持系中差異表達(dá)。為了更好的研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育與能量代謝差異基因之間的關(guān)聯(lián),本研究以紅麻不育系(P3A)及相應(yīng)保持系(P3B)為實(shí)驗(yàn)材料,提取了高質(zhì)量紅麻總DNA和總RNA,克隆了戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶基因6-PGDH和短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶基因(ADH1);同時(shí)對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了半定量RT-PCR分析;并構(gòu)建6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶RNA干擾載體,主要結(jié)果如下:
　　(1)成功的從紅麻

4、花藥中提取了高質(zhì)量的總DNA和總RNA。
　　(2)根據(jù)不育系(P3A)和保持系(P3B)花藥轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果,參考前期DNA微陣列差異分析結(jié)果,嚴(yán)格篩選相關(guān)差異基因序列片段,同時(shí)參考同源克隆所得片段,并提交NCBI,以Blast N,Blast P進(jìn)行檢索,再與其他物種的6-PDGH和ADH1基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。在確認(rèn)數(shù)據(jù)可信度的前提下,用生物信息學(xué)方法獲得全長(zhǎng)cDNA拼接序列,并分別以紅麻不育系(P3A)和保持系(P3

5、B)的花藥cDNA以及總DNA為模板克隆了紅麻6-PGDH基和ADH1基因全長(zhǎng)。測(cè)序分析結(jié)果表明,紅麻6-PGDH和ADH1基因擴(kuò)增序列與其它植物的6-PGDH和ADH1基因保守序列具有很高的同源性,說(shuō)明所擴(kuò)增的片段是正確的基因片段。紅麻6-PGDH基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)、總DNA中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的CDS區(qū)大小均為1458bp,編碼485個(gè)氨基酸殘基,無(wú)內(nèi)含子。紅麻ADH1基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)中PC

6、R擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為1300bp,在總DNA中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2256bp,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的CDS區(qū)大小均為1071bp,編碼356個(gè)氨基酸殘基,包含8個(gè)外顯子。
　　(3)半定量RT-PCR分析得出:紅麻6-PGDH和ADH1基因在保持系(P3B)中的表達(dá)量明顯大于不育系(P3A)。
　　(4)本研究以紅麻6-PGDH基因?yàn)榘谢?構(gòu)建特異沉默該基因的RNAi干擾載體。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明,以紅麻6-PGDH基因?yàn)榘袠?biāo)的RN