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文檔簡介
1、肌肉生長抑制素(Myostatin)屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族(Transforming Growth Factor beta,TGF-β)成員,是脊椎動物肌肉發(fā)育的主導調(diào)控基因之一,其功能是抑制MyoD家族成員轉(zhuǎn)錄活性,負向調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。研究表明,抑制Myostatin基因的活性,能夠促進肌肉的生長,提高動物的產(chǎn)肉量。本實驗通過對加州鱸(Micropterus salmoides)Myostatin基因的結(jié)構(gòu)、功能及抑制物Folli
2、statin的研究,探討魚類肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機制,為培育快速生長的養(yǎng)殖品種提供理論依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。 本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)從加州鱸成魚肌肉總RNA中擴增得到Myostatin cDNA序列,對其進行了序列測定和分析,結(jié)果表明加州鱸MyostatincDNA總長2640 bp,其中開放閱讀框長為1134 bp,編碼377個氨基酸,含22個氨基酸的信號肽、N-端前肽、蛋白酶水解位點(RARR)和緊接其后109個氨基酸
3、的C端生物活性區(qū)。與GenBank中已知的條紋狼鱸、金頭鯛、斑馬魚、虹鱒、斑點叉尾鲴、人、豬、雞Myostatin序列相比較,核苷酸序列同源性為63%~94.4%,推導的氨基酸同源性為61.4%~96%,其中C端生物活性區(qū)氨基酸同源性為88.1%~100%,具有很高的保守性,高度的保守性反映了該基因受到了高度的進化限制及功能的重要性。加州鱸Myostatin C端生物活性區(qū)含有9個半胱氨酸殘基,半胱氨酸殘基的數(shù)量和位置與其它脊椎動物的相
4、一致,表明它們在維持該蛋白活性中的重要作用。 為進一步了解魚類Myostatin基因表達的調(diào)控方式,采用PCR和基因組步移技術(shù)獲得了加州鱸Myostatin的基因組DNA序列,該序列總長為5.64 kb,其中5'側(cè)翼序列長為1463 bp,3'側(cè)翼序列長為294 bp,轉(zhuǎn)錄區(qū)序列長為3.883 kb。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包含3個外顯子和2個內(nèi)含子,長度分別為488 bp、371 bp、1779 bp、390 bp和855bp。每個內(nèi)含子
5、都以GT開頭,AG結(jié)尾,符合GT-AG法則。內(nèi)含子2中有一個8個CA重復的微衛(wèi)星位點。序列分析結(jié)果表明加州鱸Myostatin啟動子中含有2個TATA box、1個CANTbox、9個E-box和一些轉(zhuǎn)錄反應(yīng)調(diào)控元件(MEF2、SRF、APl、MTBF等)。通過對加州鱸與牛Myostatin基因啟動子中E-box的分布比較,推測E6是影響該基因表達最重要的一個反應(yīng)元件。 卵泡抑素(Follistatin)是Myostatin的抑
6、制蛋白,為探討Myostatin受抑制時對肌肉生長產(chǎn)生的作用,獲得Follistatin重組蛋白將有助于實驗的深入開展,為此采用:RT-PCR和RACE技術(shù)從加州鱸成魚卵巢總RNA中擴增得到FollistatincDNA序列,全長為1444bp,其中開放閱讀框長為966 bp,編碼321個氨基酸,包括信號肽31個氨基酸,成熟肽290個氨基酸。將成熟肽cDNA插入表達載體pET-32a(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌,IPTG誘導表達,SDS-PAG
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