地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗證.pdf

1、地黃是大宗常用中藥材，是近年來中藥研究的熱點之一，被應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品等多種領(lǐng)域，市場需求量大。目前，地黃和其他植物一樣生活在諸多脅迫因素影響的環(huán)境中，其耐脅迫機理需深入研究，耐脅迫品種培育的問題亟待解決。另一方面，雖然植物包括地黃的基因及其功能的研究不斷深入，但是，明確具體功能的基因并不太多。地黃耐脅迫基因的研究可為這些問題的研究與解決提供一些基礎(chǔ)與參考。RghBNG基因是我們2013年首次從地黃中克隆的未知功能基因。為了進一步

2、研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能，本研究克隆了RghBNG的同源基因和啟動子序列，研究了RghBNG的亞細胞定位，分析了在非生物因素和植物生長調(diào)節(jié)劑下RghBNG基因的表達。主要結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR技術(shù)擴增RghBNG基因的ORF區(qū)，共獲得5個片段，其中，548bp的片段為RghBNG基因(JX290369)，1974bp的片段為RghBNGL基因。生物信息學分析表明，該兩條基因序列整體相似性達21.35％，其局部一致性為9

3、8.83％。RghBNGL基因包含一個486bp的開放閱讀框(ORF)，編碼161個氨基酸殘基，但在NCBI中未找到同源氨基酸序列。該基因編碼蛋白的氨基酸相對分子量為18571.8Da，等電點為9.45，編碼帶正電荷堿性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲構(gòu)成，該蛋白沒有信號肽，為非分泌蛋白。
　　2.用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中克隆得到兩條基因。其中，一條385bp，在植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫P

4、LACE預測，類似啟動子序列，含3處TATAbox，兩處蛋白結(jié)合位點HD-Zip3，1處光反應(yīng)元件CATT-motif，光響應(yīng)要素chs-CMA2a，防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件(TC-richrepeats)、赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、2處胚乳表達所需的順式調(diào)控元件Skn-1_motif和參與光合作用基因的光調(diào)節(jié)表達以及葉片特異性表達的Ⅰ-box，我們初步認為本研究克隆的序列可能是RghBNG基因的啟動子的某段區(qū)域;另一條578bp，

5、包含一個390bp的開放閱讀框(ORF)，編碼1條含130個氨基酸殘基的多肽鏈，與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達81％～91％;，其所編碼的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纖維素合酶基因編碼的氨基酸序列的同源性高達83％～99％;其推測蛋白質(zhì)具有纖維素合酶的結(jié)構(gòu)域。
　　3.探究NAA、6-BA、赤霉素、汞離子、鉻離子、鹽、溫度、紫外光對地黃基因RghBNG表達量的影響。利用實時熒光定量

6、PCR技術(shù)檢測基因RghBNG在9種誘導因素處理過的地黃根、葉兩個組織中的表達量。結(jié)果表明紫外光照可以誘導RghBNG蛋白在葉中的高表達量，在Gr6+、赤霉素和鹽的的影響下表達量次之;在高溫、Hg2+、6-BA的影響下RghBNG的RNA的表達量與對照相比呈現(xiàn)出被抑制的狀態(tài);在根中，鉻離子誘導RghBNG表達量最高，赤霉素誘導的表達量次之，6-BA對其顯示出抑制作用。結(jié)果表明，RghBNG基因的表達與地黃響應(yīng)非生物和植物生長激素脅迫機制

7、有關(guān)，耐鉻和鹽脅迫，受赤霉素誘導。
　　4.分別以PstⅠ和HindⅢ作為上下游酶切位點，將RghBNG的ORF片段插入表達載體pCAMBIAl302，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIAl302-RgBNG-GFP，采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101并轉(zhuǎn)染預處理的洋蔥表皮，pCAMBIAl302-GFP為對照，進行培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GFP分布在洋蔥細胞的細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜內(nèi)，RghBNG分布在細胞質(zhì)和細胞膜上。