體內(nèi)篩選和功能驗(yàn)證胰腺癌肺轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因.pdf

1、目的：利用混合多克隆細(xì)胞亞群裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和基因組PCR的方法進(jìn)行篩選和驗(yàn)證具有肺轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞亞群、相關(guān)候選基因以及遺傳通路，為進(jìn)一步研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)，為胰腺癌的臨床診斷、治療以及預(yù)防提供新的策略和靶點(diǎn)。
　　 方法：分別培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室前期得到的45個(gè)胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，取1×105個(gè)細(xì)胞/克隆，將45個(gè)細(xì)胞克隆混合為多克隆細(xì)胞亞群。混合細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后，在第一輪的動(dòng)物篩選試驗(yàn)中，通過尾靜

2、脈的注射方式接種混合的多克隆細(xì)胞亞群到裸鼠體內(nèi)，1×106個(gè)細(xì)胞/只，裸鼠分為通過飲水給予強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Dox)實(shí)驗(yàn)組和普通飲水對(duì)照組，每組8只。待裸鼠出現(xiàn)瀕死體征時(shí)，取其肺組織（含轉(zhuǎn)移灶）原代培養(yǎng)肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群，提取其基因組DNA進(jìn)行PCR分析，比較兩組裸鼠特異基因檢出率。
　　 在第二輪的動(dòng)物篩選試驗(yàn)中，分別通過尾靜脈和腹腔注射2種方式接種裸鼠，1×106個(gè)細(xì)胞/只，每種接種方式又分為給予強(qiáng)力霉素實(shí)驗(yàn)組和

3、普通飲水對(duì)照組，每組8只，余操作(原代培養(yǎng)、基因組PCR)同第一輪動(dòng)物篩選實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)通過兩輪動(dòng)物體內(nèi)篩選具有高轉(zhuǎn)移特性的胰腺癌細(xì)胞株，經(jīng)原代培養(yǎng)成功得到46個(gè)具有肺轉(zhuǎn)移能力的胰腺癌細(xì)胞亞群。第一輪經(jīng)尾靜脈接種瘤細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)篩選和基因組PCR結(jié)果顯示：在沒有給予強(qiáng)力霉素的8只裸鼠中有5只檢測(cè)到SQSTM1基因，檢出率為62.5％(5/8)；而在給予強(qiáng)力霉素的8只裸鼠中只有3只檢測(cè)到SQSTM1基因，檢出率為37.

4、5%(3/8)。給予強(qiáng)力霉素組裸鼠平均存活時(shí)間為92天；普通飲水對(duì)照組裸鼠平均存活時(shí)間為75天。
　　 第二輪經(jīng)尾靜脈接種瘤細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)篩選和基因組PCR結(jié)果顯示：在沒有給予強(qiáng)力霉素的8只裸鼠中有6只檢測(cè)到SQSTM1基因，檢出率為75%(6/8)；而在給予強(qiáng)力霉素的8只裸鼠中只有3只檢測(cè)到SQSTM1基因，檢出率為37.5%(3/8)。給予強(qiáng)力霉素組裸鼠平均存活時(shí)間為86天，肺臟組織肉眼未見明顯轉(zhuǎn)移灶；普通飲水對(duì)照組裸鼠存活

5、時(shí)間為74天，肺臟組織肉眼可見明顯轉(zhuǎn)移灶。
　　 第二輪經(jīng)腹腔接種瘤細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)篩選和基因組PCR結(jié)果顯示：62.5%(5/8)沒有給予強(qiáng)力霉素的裸鼠中肺轉(zhuǎn)移檢測(cè)到SQSTM1基因，而在給予強(qiáng)力霉素的裸鼠中只有33.34%(2/6)的肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群能夠檢測(cè)到SQSTM1基因。給予強(qiáng)力霉素組裸鼠平均存活時(shí)間為87天；普通飲水對(duì)照組裸鼠存活時(shí)間為76天。
　　 兩輪裸鼠體內(nèi)篩選和基因組PCR分析其他候選基因，包括Sema4

6、b，Ube2k和Gna13，均未檢測(cè)到表達(dá)。表明強(qiáng)力霉素介導(dǎo)的SQSTM1基因在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中其關(guān)鍵作用。Western-Blot、Q-PCR顯示強(qiáng)力霉素能夠調(diào)控SQSTM1基因的表達(dá)和關(guān)閉。
　　 結(jié)論：多克隆混合同步篩選可驗(yàn)證得到胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群和與其關(guān)聯(lián)的基因。SQSTM1基因在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用；在“全基因組隨機(jī)基因調(diào)控技術(shù)平臺(tái)”的基礎(chǔ)上，通過給予或不給予強(qiáng)力霉素能夠?qū)崿F(xiàn)SQSTM1基因表達(dá)的人為控制。