Myostatin基因失活轉(zhuǎn)基因綿羊的制備及表型初步分析.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN），屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族成員，是骨骼肌生長(zhǎng)和發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)myostatin基因敲除小鼠的骨骼肌重量增加了2-3倍，肌肉組織發(fā)生廣泛的增生和肥大。Myostatin自然突變的牛也表現(xiàn)出肌肉異常發(fā)達(dá)的“雙肌”表型。Myostatin基因突變小鼠和牛的肌肉重量顯著增加，為通過(guò)抑制綿羊myostatin基因表達(dá)提高綿羊產(chǎn)肉率提供了很好的動(dòng)物模型。因此，本研究以綿羊myo

2、statin基因?yàn)榘谢?，分別利用RNA干擾和基因打靶技術(shù)制備myostatin失活的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊，探索一條提高綿羊產(chǎn)肉率的技術(shù)路線，為培育高產(chǎn)肉性能的肉用綿羊新品種奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究對(duì)死亡克隆羔羊的各種組織進(jìn)行了組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，初步分析了微小RNA（microRNA）在克隆綿羊胎盤中的表達(dá)和功能。本文的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.利用PCR克隆綿羊U6啟動(dòng)子，以EGFP熒光報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證綿羊U6啟動(dòng)子的活性；利用軟件設(shè)計(jì)

3、4個(gè)針對(duì)綿羊myostatin基因的shRNA（shMSTN），以熒光定量RT-PCR方法篩選有效抑制myostatin基因表達(dá)的shMSTN；以電轉(zhuǎn)化法將shMSTN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞，篩選myostatin基因穩(wěn)定沉默的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞；再利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備myostatin基因沉默的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊；利用PCR和westernblot對(duì)轉(zhuǎn)基因綿羊進(jìn)行鑒定；通過(guò)稱重檢測(cè)轉(zhuǎn)基因綿羊的日增重情況，利用組織學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因

4、綿羊肌肉組織進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從綿羊基因組中PCR擴(kuò)增獲得兩個(gè)綿羊U6啟動(dòng)子（sU6-1和sU6-2），sU6-1和sU6-2含有U6啟動(dòng)子典型的TATA-box、PSE、SPH和OCT結(jié)構(gòu)元件，具有啟動(dòng)shRNA表達(dá)的活性，可用于綿羊RNAi的研究；篩選獲得一個(gè)高效抑制myostatin基因表達(dá)的shMSTN3，干擾效率達(dá)到87％；經(jīng)G418篩選獲得46個(gè)抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)PCR鑒定其中12個(gè)為陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核

5、移植獲得克隆胚胎，胚胎的卵裂率為68%，囊胚率為15%。將克隆胚胎移植到74只受體羊中，35天后有26只綿羊妊娠，其中5只受體羊懷孕足月，出生5只克隆羔羊，其中1只出生后即死亡，1只在出生22天后死亡，另外3只目前健康存活。出生的羔羊基因組中整合有外源shRNA基因，肌肉組織中myostatin表達(dá)水平明顯下降。轉(zhuǎn)基因克隆綿羊日增重高于對(duì)照組，并且肌肉細(xì)胞明顯肥大。以上研究結(jié)果表明，將RNA干擾和體細(xì)胞核移植技術(shù)相結(jié)合可制備myosta

6、tin基因沉默的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊，為培育高產(chǎn)肉率肉用綿羊新品種奠定基礎(chǔ)。
　　2.利用長(zhǎng)片段PCR技術(shù)和常規(guī)分子克隆技術(shù)制備綿羊myostatin基因打靶載體；以電轉(zhuǎn)化法將myostatin基因打靶載體轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞，以G418和GANC篩選制備myostatin基因敲除的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞；再利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備myostatin基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了針對(duì)myostatin第三外顯子的置

7、換型基因敲除載體pNL2-MSTN。共篩選獲得25個(gè)抗性細(xì)胞克隆，PCR鑒定其中3個(gè)為myostatin基因敲除的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性細(xì)胞核移植后，克隆胚胎的卵裂率為40%，囊胚率為9%。將克隆胚胎移植到22只受體綿羊中，胚胎移植35天后有6只綿羊妊娠，兩個(gè)月后有5只綿羊返情，另外1只綿羊未獲得胎兒，胎兒可能被母體吸收。以上研究結(jié)果表明，通過(guò)基因打靶技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)可構(gòu)建myostatin基因敲除成纖維細(xì)胞和克隆胚胎，myostatin

8、基因敲除克隆胚胎早期發(fā)育良好。本研究初步建立了體細(xì)胞基因打靶技術(shù)平臺(tái)，為制備myostatin基因敲除動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。
　　3.本研究對(duì)死亡轉(zhuǎn)基因克隆羔羊各組織器官進(jìn)行組織學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。利用熒光定量RT-PCR方法分析發(fā)育相關(guān)miR-15、miR-16、miR-21、miR-34a和miR-127在克隆綿羊胎盤中的表達(dá)情況。再利用生物信息學(xué)軟件和EGFP熒光報(bào)告系統(tǒng)分析miR-127和miR-21的靶基因。結(jié)果顯示，死亡克隆綿羊

9、肺不張、發(fā)育存在缺陷，同時(shí)肝臟、腎臟和脾臟存在不同程度的病變，而克隆胎盤重量和胎盤凸重量高于對(duì)照胎盤，克隆胎盤凸的數(shù)目少于對(duì)照組。與正常對(duì)照胎盤相比，發(fā)育相關(guān)miR-127和miR-21在克隆胎盤中的表達(dá)量分別增加3.4倍和5.1倍（P<0.05）；miR-15、miR-16和miR-34a的表達(dá)水平在克隆綿羊胎盤與對(duì)照綿羊胎盤中差異不顯著（P>0.05）。EGFP熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)印記基因RTL1和磷酸酶基因（PTEN）分別為miR