花葉矢竹葉綠素生物合成關(guān)鍵基因PjPORB和PjCAO克隆與功能分析.pdf

1、葉綠素(Chlorophyll，Chl)合成影響植物光合效率，是影響作物產(chǎn)量的重要因素。Chl生物合成途徑（L-谷氨酰-tRNA→葉綠素a→葉綠素b）總共15步反應(yīng)，涉及15種酶的參與，其中任何一個(gè)編碼這些酶的基因發(fā)生突變都可能會(huì)引起葉片Chl的含量發(fā)生變化，從而表現(xiàn)為葉色異常甚至導(dǎo)致植株死亡。花葉矢竹(Pseudosasajaponica cv.Akebonosuji)葉色在生長發(fā)育過程中，呈現(xiàn)綠色、白色、綠白相間條紋（條紋的深淺、形

2、狀和出現(xiàn)個(gè)數(shù)和位置都具有不確定性），前期的葉綠素前體物質(zhì)測定結(jié)果表明花葉矢竹葉色的異?？赡芘c其葉綠素生物合成途徑原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)和葉綠素酸酯a氧化酶(CAO)催化步驟的異常有關(guān)，本研究從這兩個(gè)關(guān)鍵酶的編碼基因PjPORB和PjCAO的分離入手開展了工作，主要結(jié)論如下:
　　 1.通過RACE方法克隆到了花葉矢竹葉綠素生物合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因PjPORB和PjCAO的全長cDNA。PjPORB基因的cDNA全長1

3、567 bp，含有一個(gè)1185bp的ORF區(qū)，編碼394個(gè)氨基酸，包含SDR家族典型的Rossmann折疊NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn);PjCAO基因的cDNA全長2070 bp，含有一個(gè)1626 bp的ORF區(qū)，編碼541個(gè)氨基酸，包含4個(gè)domain:前導(dǎo)肽序列，A domain，B domain和C domain，其中C domain含有一個(gè)典型的Rieske鐵硫配位中心。
　　 2.通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR，分析了Pj

4、PORB和PjCAO在花葉矢竹根、莖和綠葉、白葉、花葉（綠條紋占葉面積大約70％以上的花葉和白條紋占葉面積大約70％以上花葉）的表達(dá)模式，結(jié)果顯示PjPORB和PjCAO基因在花葉矢竹不同組織均有表達(dá)，在不同葉色葉片的發(fā)育過程中，PjPORB基因的mRNA水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，PjCAO基因的mRNA水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，并且表達(dá)程度各不相同，表明PjPORB和PjCAO基因可能通過影響葉綠素合成而在花葉矢竹葉片呈色過程中發(fā)揮了

5、重要作用。
　　 3.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pC1301-PjPORB和pC1301-PjCAO轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。潮霉素對(duì)種子的抗性篩選以及GUS染色、PCR和RT-PCR對(duì)再生植株的陽性鑒定表明PjPORB和PjCAO基因已成功轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)性狀較穩(wěn)定的T1代轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量測量結(jié)果表明，過表達(dá)PjPORB和PjCAO擬南芥植株的葉綠素含量較野生型高，說明PjPORB和PjCAO基因可能參與了擬南芥