金龜子綠僵菌耐夏季高溫能力的種內(nèi)變異、一新孢壁蛋白的基因克隆及功能鑒定.pdf

1、作為真菌殺蟲(chóng)劑的有效成份，金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的氣生分生孢子很容易在諸如稻米、大麥等谷物固體基質(zhì)上大量生產(chǎn)，并配制成適當(dāng)劑型用于害蟲(chóng)防治。分生孢子對(duì)環(huán)境脅迫的耐受力決定了其制劑的貯存穩(wěn)定性和田間持效性，而夏季高溫就是最重要的脅迫因子之一。建立定量合理、結(jié)果可靠、簡(jiǎn)便易行的定量評(píng)價(jià)體系，是篩選耐夏季高溫生產(chǎn)菌株的重要基礎(chǔ)。另一方面，孢壁是由多種蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和多糖類(lèi)物質(zhì)組成的孢子保護(hù)結(jié)構(gòu)，尤其眾多孢

2、壁蛋白的功能，目前可知者寥寥。為此，作者研究建立了生防真菌耐夏季高溫能力的定量評(píng)價(jià)體系，并應(yīng)用于不同寄主和地理來(lái)源的18株綠僵菌分生孢子的耐熱力比較測(cè)定；在此基礎(chǔ)上對(duì)18株金龜子綠僵菌的甲酸可抽提的孢壁蛋白進(jìn)行了比較分析，從中發(fā)現(xiàn)了一條9.9 kDa的全新孢壁蛋白，并成功地進(jìn)行了基因克隆和功能鑒定。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果分述如下：
　　 金龜子綠僵菌耐夏季高溫能力的種內(nèi)變異對(duì)不同寄主和地理來(lái)源的18株綠僵菌，包括8株變種未知的金龜子

3、綠僵菌(M. anisopliae；用Ma表示)、4株金龜子變種(M。anisopliae var. anisopliae； Maan)和6株蝗變種(M. anisopliae var. acridum； Maac).進(jìn)行了48℃熱脅迫實(shí)驗(yàn)和10-35℃下的菌落生長(zhǎng)數(shù)率的測(cè)定。首先，用稻米基質(zhì)上生產(chǎn)的孢子粉配制成孢子懸液，于玻璃試管中在48℃下水浴脅迫，每隔15 min從試管中取樣涂板，培養(yǎng)24 h并測(cè)定殘存活孢率，直至活孢率等于或接近

4、于零為止。用供試菌株相對(duì)于對(duì)照的殘存指數(shù)擬合衰變模型(0.975≤r2≤0.999)，再用擬合的模型參數(shù)計(jì)算各菌株的半致死時(shí)間(LTso)，作為其耐受48℃熱脅迫能力的定量指標(biāo)。所獲LTso在供試菌株中差異很大，源于非洲蝗蟲(chóng)7株菌的LTso平均高達(dá)110(73-150) min，但在10和15℃下不能形成平板菌落；源于其他寄主的5個(gè)菌株在10-35℃下都能生長(zhǎng)良好，但平均LT50僅16(10-26)min。根據(jù)供試菌株的LT50，選出對(duì)

5、48℃熱脅迫耐受能力強(qiáng)、中、弱的三個(gè)典型菌株，分別對(duì)其進(jìn)行38、40、42和45℃下的耐熱力測(cè)定，其中38℃下的測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4天。結(jié)果顯示，隨著脅迫溫度的升高，LT50呈下降趨勢(shì)。耐熱力強(qiáng)、中、弱三株菌的LT50從38℃下的8256、1612和507 min分別降至48℃下的167、53和20 min。三株典型菌株的LT50與供試5個(gè)脅迫溫度均存在顯著的逆相關(guān)(0.881≤r2≤0.980)。由此，準(zhǔn)確高效篩選用于害蟲(chóng)防治的耐夏季高溫的

6、優(yōu)良菌株，最佳脅迫溫度是45-48℃，脅迫實(shí)驗(yàn)的時(shí)間在6h以?xún)?nèi)。
　　 金龜子綠僵菌孢壁蛋白抽提與組分分析用甲酸法抽提18株供試真菌分生孢子的孢壁蛋白，抽提物中孢壁蛋白的含量在不同菌株間差異極顯著(F17.36=267.0，P<0.01)，最高的菌株Ma2421為50.2±1.2μg/mg孢子，而一株蝗變種菌株Maac6421僅有3.4±0.5μg/mg。種內(nèi)不同變種間的比較顯示，8株金龜子綠僵菌的平均含量為28.4±12.3μ

7、g/mg，4株金龜子變種的平均含量為27.3±15.1μg/mg，均顯著高于6株蝗變種的平均含量14.7±8.4μg/mg。此外，變種內(nèi)不同菌株問(wèn)的孢壁蛋白含量也差異極顯著(Ma: F7，16=212.9，P<0.01；Maac: F5.12=263.2，P<0.01；Maan: F3，8=238.2，P<0.01)。對(duì)不同菌株孢壁蛋白的組分進(jìn)行SDS- PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)多條條帶，分子量9.0-90 kDa不等，菌株間孢壁蛋白組分

8、差異極大；僅蛋白含量最低的Maac6421菌株無(wú)可分辯條帶。一條約9.9 kDa的條帶為多個(gè)供試菌株共有，命名為CWP10，作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行深入研究。
　　 一種新孢壁蛋白CWP10的基因克隆與功能鑒定將供試菌株分生孢子甲酸抽提物的SDS-PAGE分析中最顯著的菌株Maan4132蛋白條帶CWP10進(jìn)行分離純化，通過(guò)N端測(cè)序和DNA擴(kuò)增，獲得了該蛋白的全長(zhǎng)基因CWP10，總長(zhǎng)為535 bp(GenBank accessionnu

9、mber: FJ548848)，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)為363 bp，含有三個(gè)大小分別為57、63和52bp的內(nèi)含子，將編碼區(qū)分隔成四個(gè)外顯子。Southem雜交顯示，CWP10在綠僵菌基因組中呈單拷貝。編碼區(qū)翻譯一條由120個(gè)氨基酸組成的蛋白肽段，DNAstar分析顯示其分子量為13.3 kDa，等電點(diǎn)為7.49。該基因及其編碼的蛋白在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到任何同源序列，因而是一全新的基因和蛋白。對(duì)照翻

10、譯后的氨基酸序列和蛋白N端測(cè)序結(jié)果，CWP10應(yīng)是一種分泌型蛋白，在其N(xiāo)端一條32個(gè)氨基酸的信號(hào)肽被切除后，成為一個(gè)9.9 kDa的成熟蛋白。經(jīng)疏水性預(yù)測(cè)分析和糖基化染色檢測(cè)，CWP10并無(wú)疏水特征，也非糖基化蛋白。其N(xiāo)端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)約10個(gè)殘基的疏水核心，并以4個(gè)極性氨基酸(QYYT)作為C端結(jié)尾。用膠體金標(biāo)記定位CWP10，發(fā)現(xiàn)其大量分布于孢壁內(nèi)層，而在孢壁外層及細(xì)胞質(zhì)中分布較少。用CWP10的多克隆抗體對(duì)18株供試菌進(jìn)行We

11、stem雜交檢測(cè)，結(jié)果在7株的分生孢子中檢測(cè)到該蛋白的存在。
　　 將來(lái)自Maan4132的新孢壁蛋白基因CWP10，通過(guò)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入無(wú)此孢壁蛋白的球孢白僵菌(Beuaveria bassiana)的野生菌株BbW中，所獲轉(zhuǎn)化子BbT的分生孢子的疏水性被顯著提高10.5％，對(duì)聚苯乙烯疏水介質(zhì)的附著力提高55.2％。但是，與野生菌株相比，轉(zhuǎn)化子的分生孢子對(duì)48℃熱脅迫和7.0J/cm2的UV.A輻射劑量及0.7 J/cm2