抗氧化性生物活性物質(zhì)對(duì)雞等級(jí)前卵泡細(xì)胞發(fā)育的影響及其機(jī)理的研究.pdf

1、家禽卵巢以其卵泡等級(jí)發(fā)育的特點(diǎn)而成為研究卵巢生物學(xué)和卵泡發(fā)育的理想模型,而卵泡顆粒細(xì)胞因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在卵泡發(fā)育中的重要作用,常被看作卵泡發(fā)育的一個(gè)重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)通過小黃卵泡顆粒細(xì)胞以及全卵泡體外培養(yǎng)模型,探討了家禽生產(chǎn)中部分重要的生殖激素、生長因子及與卵泡發(fā)育相關(guān)的抗氧化性生物活性物質(zhì)對(duì)卵泡粒細(xì)胞生長發(fā)育和功能的影響及其作用機(jī)理,以期為家禽優(yōu)勢(shì)卵泡選擇及繁殖性能的提高提供理論依據(jù)。1.雞等級(jí)前卵泡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化-卵泡刺激素和

2、前列腺素對(duì)等級(jí)前卵泡發(fā)育的影響
　　 本文首先利用形態(tài)學(xué)方法研究了雞等級(jí)前卵泡中顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞在發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)的變化。從有規(guī)則產(chǎn)蛋周期的三黃母雞中取出等級(jí)前卵泡,按照其直徑分為小白卵泡(SWF,1～3 mm)、大白卵泡(LWF,3～5 mm)、小黃卵泡(SYF,5～6 mm)和大黃卵泡(LYF,6～9 mm)。各級(jí)卵泡用4％多聚甲醛固定24 h,然后包埋并切片,厚度5μm。切片用蘇木精-伊紅染色或用增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)

3、免疫組織化學(xué)染色。等級(jí)前卵泡組織學(xué)研究結(jié)果表明:SWF只有一層顆粒細(xì)胞,LWF中出現(xiàn)兩層顆粒細(xì)胞,而SYF和LYF中則有多層顆粒細(xì)胞。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,卵泡膜層和顆粒細(xì)胞層厚度隨著卵泡直徑的變化而顯著增加。SYF和LYF的膜細(xì)胞層的厚度是最大的(P＜0.05)。顆粒細(xì)胞的密度度隨著卵泡直徑的變化而顯著增加(P＜0.05)。與LWF、SYF和LYF相比,SWF的顆粒細(xì)胞的面積較小(P＜0.05)。PCNA免疫組化染色表明:和LYF相比,PCN

4、A標(biāo)記指數(shù)(PCNA-LI)在SWF、LWF和SYF中較高。因此,在卵泡的發(fā)育過程中,膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在形態(tài)和增殖特性上具有階段特異性。卵泡體外懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,卵泡刺激素(FSH)和前列腺素PGE1刺激SYF和LYF中顆粒細(xì)胞的增殖,但對(duì)膜細(xì)胞無顯著促增殖作用。由此推測,FSH和PGE1主要通過刺激顆粒細(xì)胞的增殖促使等級(jí)前卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。2.人參皂甙對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究
　　

5、人參屬五加科多年生草本植物,其中含有的人參皂甙(GS)因其抗氧化特性而作為保健品,具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗疲勞和抗衰老等功效。本文研究了GS對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。等級(jí)前卵泡在0.5％胎牛血清(FCS)中預(yù)培養(yǎng)16 h后換成無血清的培養(yǎng)液,其中含10μg/ml胰島素,5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉(ITS培養(yǎng)液),同時(shí)單獨(dú)添加10gμg/ml GS處理24 h。結(jié)果表明:GS

6、顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜層和顆粒層細(xì)胞的增殖,提示GS可通過刺激等級(jí)前卵泡細(xì)胞的增殖而促使其進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。從SYF中分離的顆粒細(xì)胞在含有0.5％FCS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng),16 h后換成無血清培養(yǎng)液并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)用PKC抑制劑H7、PKC激活劑PMA單獨(dú)或與GS聯(lián)合處理24 h。隨后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和GS作用機(jī)理的研究。結(jié)果顯示:當(dāng)GS濃度在0.1～10μg/ml范圍時(shí),顆粒細(xì)胞的數(shù)量呈顯著上升趨勢(shì),并呈一定的劑

7、量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí),這一效應(yīng)可以被H7所抑制,但可被PMA所加強(qiáng)。顆粒細(xì)胞的PCNA-LI統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖活性與顆粒細(xì)胞的數(shù)目變化呈現(xiàn)類似的變化。Western印跡法表明10μg/ml GS可促進(jìn)顆粒細(xì)胞中PKC從胞質(zhì)到胞膜的轉(zhuǎn)移,而H7則抑制此效應(yīng)。同時(shí),GS上調(diào)顆粒細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1/周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)和周期蛋白E/CDK2mRNA的表達(dá)。然而,用PKC抑制劑H7則減弱了這一刺激效應(yīng)。由此推測,GS通過上調(diào)顆

8、粒細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2的表達(dá)來刺激顆粒細(xì)胞的增殖,從而促使等級(jí)前卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。3.大豆黃酮對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)利用全卵泡培養(yǎng)和顆粒細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)模型探討了植物性抗氧化劑大豆黃酮(DAI)對(duì)產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡及顆粒細(xì)胞增殖的影響。等級(jí)前卵泡在0.5％FCS中預(yù)培養(yǎng)16 h后換成無血清的ITS培養(yǎng)液,同時(shí)單獨(dú)添加10～1000 ng/ml的DAI處理24 h。結(jié)果

9、表明:DAI顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜層和顆粒層細(xì)胞的增殖,提示DAI通過刺激等級(jí)前卵泡細(xì)胞的增殖而促使其進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。采用機(jī)械法分散產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞。培養(yǎng)液為含0.5％FCS的M199培養(yǎng)液。顆粒細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)16 h后,撤去血清,換用ITS培養(yǎng)液。細(xì)胞用DAI處理24 h后對(duì)其增殖活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:10～1000 ng/ml的DAI處理可顯著增加顆粒細(xì)胞的數(shù)目(P＜0.05),這一刺激作用可被雌激素受體

10、阻斷劑他莫昔芬所阻斷,并呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí),顆粒細(xì)胞的BrdU-LI結(jié)果顯示出細(xì)胞的增殖活性與其數(shù)目的變化呈現(xiàn)出相似的變化。由此推測,DAI可通過雌激素活性刺激顆粒細(xì)胞的增殖而促使等級(jí)前卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。
　　 總之,本實(shí)驗(yàn)通過在體的形態(tài)學(xué)和免疫組化方法研究了產(chǎn)蛋雞等級(jí)前卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞數(shù)量的變化,膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在形態(tài)和增殖特性上呈現(xiàn)出階段特異性。顆粒細(xì)胞的增殖活性隨等級(jí)前卵泡的發(fā)育而降低。全卵泡體

11、外懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,FSH和PGE1主要通過刺激顆粒細(xì)胞的增殖而促使等級(jí)前卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育；植物性抗氧化劑GS和DAI可顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF中顆粒細(xì)胞的增殖,促使等級(jí)前卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。利用等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)模型證明:GS可上調(diào)顆粒細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2 mRNA的表達(dá)來促進(jìn)其增殖,PKC信號(hào)途徑可能參與GS對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控；DAI可通過雌激素樣作用顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果在