普通菜豆P5CS基因的克隆、功能驗證及單核苷酸多態(tài)性.pdf

1、普通菜豆(PhaseoleaevulgarisL.)是人類主要食用豆類作物之一，干旱、鹽害等逆境已成為影響普通菜豆生產(chǎn)的主要限制因素。因此，研究普通菜豆抗逆分子機理，發(fā)掘并利用抗旱、耐鹽基因，改良普通菜豆品種，對保障我國糧食安全、降低生產(chǎn)成本具有重要理論和現(xiàn)實意義。 本研究利用候選基因法克隆普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS，應(yīng)用實時定量PCR分析基因?qū)δ婢趁{迫的應(yīng)答，通過轉(zhuǎn)化模式植物研究其抗逆功能，并應(yīng)用直接測序法檢測基因的單核

2、苷酸多態(tài)性(SNP)，獲得以下結(jié)果： 1、克隆出兩個普通菜豆脯氨酸合成酶基因，分別命名為PvP5CS1和PvP5CS2。PvP5CS1基因全長2.246kb，具有一個2.151kb的開放閱讀框；PvP5CS2基因全長2.340kb，包含一個2.148kb的開放閱讀框，其DNA序列包含20個外顯子和19個內(nèi)含子。PvP5CS1和PvP5CS2基因與豇豆VaP5CS基因核苷酸序列的相似性分別為95.1％和82.6％，氨基酸序列的相似

3、性分別為93.2％和79.9％。兩個基因都包含有高等植物P5CS蛋白質(zhì)的主要功能域：ATP結(jié)合位點、2個亮氨酸結(jié)構(gòu)域、NADPH結(jié)合位點、谷氨酰激酶結(jié)構(gòu)域和谷氨酸半醛結(jié)構(gòu)域。 2、PvP5CS1和PvP5CS2基因的表達明顯受干旱、NaCl和低溫誘導(dǎo)。干旱脅迫下，葉片中兩個基因的表達在第4天達到最大值，脯氨酸的積累到第8天才達到最大值。鹽脅迫2h，葉片中兩個基因出現(xiàn)表達高峰，根中到6h才達到最大值，但是脯氨酸含量的最大值都出現(xiàn)在

4、第9h。冷處理2h，誘導(dǎo)葉片中兩個基因和根中PvP5CS2基因達到表達高峰，葉片和根中脯氨酸積累的高峰分別出現(xiàn)在第12h和24h，冷脅迫抑制PvP5CS1基因在根中表達。 3、正常條件(CK)、滲透脅迫(150mM和250mM甘露醇)和鹽脅迫(150mMNaCl)下，轉(zhuǎn)PvP5CS1基因擬南芥株系平均脯氨酸含量分別是野生型的1.38、2.68、1.30和1.30倍。轉(zhuǎn)基因擬南芥的滲透耐性、耐鹽性和抗旱性得到改善。在150mMNa

5、Cl和150mM甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系種子的發(fā)芽率顯著高于野生型(P<0.001)，幼苗相對電導(dǎo)率比均顯著低于野生型，根長顯著大于野生型(P<0.05)；300mMNaCl處理15d，轉(zhuǎn)基因株系幼苗的存活率顯著高于野生型(P<0.05)；干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的存活率大于野生型。 4、轉(zhuǎn)PvP5CS2基因煙草植株表現(xiàn)出較強的抗旱性，在水分脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量、葉片萎蔫數(shù)和葉片相對含水量分別是野生型的2.3倍、0.8

6、8倍和1.26倍。 5、在27份普通菜豆的PvP5CS2中共發(fā)現(xiàn)63個SNP位點，其中編碼區(qū)18個，非編碼區(qū)45個，轉(zhuǎn)換：顛換為1.25:1；插入缺失位點224個，全部出現(xiàn)在內(nèi)含子區(qū)域。PvP5CS2是一個相對保守的基因，在進化過程中受到強烈負(fù)選擇影響(Ka/Ks<0.5)，核苷酸多樣性值(π)為0.00483，安第斯基因庫和中美洲基因庫內(nèi)部核苷酸的變異低于基因庫之間的變異。PvP5CS2基因的單核苷酸多態(tài)性和普通菜豆的抗旱性沒