Ⅰ型干擾素受體在雞消化道各器官的載量與分析.pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是由生物體細(xì)胞受到病毒或其它誘生劑的作用而產(chǎn)生的分泌性糖蛋白，具有廣泛生物學(xué)活性，如抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。干擾素按其與受體結(jié)合的原則，分為Ⅰ型和Ⅱ型，后來(lái)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素按其與抗體結(jié)合的抗原性不同又可分為兩類，故把Ⅰ型干擾素又分為α、β兩大類，將原來(lái)的Ⅱ型干擾素命名為γ。IFN-α和IFN-β的分子有序列同源性，共用相同的細(xì)胞表面受體——Ⅰ型干擾素受

2、體(IFNAR)，IFN-γ是一種同源二聚體糖蛋白，其細(xì)胞表面受體為Ⅱ型干擾素受體(IFNGR)。Ⅰ型干擾素受體由兩條鏈組成，α鏈（IFNAR-1）和β鏈(IFNAR-2)，IFNAR-1的生物學(xué)功能與干擾素結(jié)合以及生物信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，而IFNAR-2的生物學(xué)功能尚未清楚。
　　IFNAR-1是IFNAR的一個(gè)重要亞單位蛋白，在干擾素與干擾素受體結(jié)合的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因此，研究IFNAR-1在雞消化道各器官的分布對(duì)分析干擾素

3、在消化道作用及吸收的部位有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)從兩方面來(lái)檢測(cè)IFNAR-1在消化道各器官的分布:一是基因?qū)用?，二是蛋白層面。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè);哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，將檢測(cè)基因IFN-β和報(bào)告基因GFP融合一體，這樣就可以減少非特異性吸附的問(wèn)題，提高了檢測(cè)方法的特異性。此外，采用哺乳動(dòng)物真核表達(dá)方式，可以保留蛋白的天然結(jié)構(gòu)和蛋白的生物活性。
　　為了進(jìn)一步研究和探尋IFNAR在消化道各器官的分布，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-

4、PCR的方法從雞脾臟中提取擴(kuò)增了IFNAR-1基因，克隆到PMD-18 T載體中構(gòu)建成實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并選取β-actin基因作為內(nèi)參基因，做出各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雞的上顎、舌、食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、直腸等器官，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)采集的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFNAR-1基因在以上各器官多少都有分布，但食管和舌部位最多。
　　我們將IFN-β基因與pE

5、GFP-N1鏈接構(gòu)建成pEGFP-N1-IFN-β重組質(zhì)粒，然后將IFN-β基因和GFP基因融合后擴(kuò)增，最后將克隆得到的基因IFN-β+GFP與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA鏈接。將重組后的質(zhì)粒pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，48h后可以通過(guò)熒光顯微鏡看融合蛋白表達(dá)的情況。表達(dá)成功后，融合蛋白采用鎳柱進(jìn)行純化，再經(jīng)過(guò)免疫印跡(Western-Blot)檢測(cè)融合蛋白的純化情況。將實(shí)驗(yàn)組

6、和對(duì)照組雞上顎、舌、食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、直腸等器官制成冰凍切片，用純化的融合蛋白浸潤(rùn)切片，在熒光顯微鏡下檢測(cè)切片熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了舌和食管能夠檢測(cè)到微弱的熒光，其余器官均檢測(cè)不到熒光。
　　此外，我們分別對(duì)口服干擾素的實(shí)驗(yàn)組雞和口服等量生理鹽水的對(duì)照組雞攻等量的新城疫病毒，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組雞死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組。綜合以上實(shí)驗(yàn)，我們可以得出干擾素受體(IFNAR)基因主要集中在舌和食管部位，即干擾素的作用部位在舌和食管;同時(shí)，