亮甲酚藍(lán)(BCB)染色法預(yù)測牛卵母細(xì)胞未來發(fā)育能力的研究.pdf

1、卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）作為胚胎體外生產(chǎn)的重要元件，其體外成熟（IVM）的質(zhì)量是影響胚胎體外生產(chǎn)（IVEP）的關(guān)鍵因素之一，直接影響著卵母細(xì)胞的激活、受精及隨后的胚胎發(fā)育能力。目前，胚胎生物技術(shù)研究主要是從屠宰場收集卵巢，由于卵巢的揀取、卵母細(xì)胞篩選的盲目性以及許多其它的因素，特別是卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟存在著明顯的不同步性，導(dǎo)致體外胚胎生產(chǎn)的效率仍然很低。利用卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，可獲得大量的廉價(jià)卵母細(xì)胞，既克服了超數(shù)排卵技術(shù)的局

2、限性，又滿足了胚胎工程技術(shù)發(fā)展的需要。本文以組織培養(yǎng)液199（TCM199）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基就牛未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)亮甲酚藍(lán)（BCB）選擇后對其體外成熟．體外受精．核移植（IVM-IVF-NT）的影響進(jìn)行了研究，并且檢測了卵母細(xì)胞成熟前后谷胱甘肽（GSI-D的濃度，從而探索了一種較理想的篩選高質(zhì)量卵母細(xì)胞的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了表皮生長因子（EGF）、β-巰基乙醇（β-ME）、亞硫磺酸（HTAU）對牛卵母細(xì)胞IVM-IVF-NT發(fā)育能力影

3、響的研究，進(jìn)而優(yōu)化體外培養(yǎng)體系，以滿足胚胎工程研究及生產(chǎn)性胚胎移植的需要，實(shí)現(xiàn)良種家畜胚胎的工廠化生產(chǎn)，加速畜牧業(yè)的發(fā)展。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1．牛未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)過13，26，39，52μmol/L的BCB染色90min后，其中用26，39，52μmol/L的BCB染色的BCB+組所占的百分率（27．7%，27．6%，31．9%）較13μmol/L的BCB染色后所占的百分率（2．1%）差異顯著；并且染色后BCB+組間的成

4、熟率差異不顯著（P>0．05），其中BCB+組（77．4%）較BCB-組（51．3%）和對照組（60．2%）的成熟率差異顯著（P<0．05），并且以26μmol/L BCB染色選擇COCs最佳；通過26μmol/L BCB染色90nun后，COCs在IVM-IVF-NT后BCB+組的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)最高并且較對照組、BCB-組差異顯著（P<0．05）。從而證明BCB染色可以被用來有效的選擇成熟前不同發(fā)育活性的牛卵母細(xì)胞。BCB染色本身

5、不能提高M(jìn)Ⅱ期卵母細(xì)胞的成熟率和體外受精率，但有助于選擇體外成熟以前有發(fā)育活性的卵母細(xì)胞。 2．COCs在經(jīng)26μmol/L，BCB染色90min后，試驗(yàn)結(jié)果顯示對照組和處理組在成熟培養(yǎng)前后谷胱甘肽的濃度（unstained組，3．801034，7．418366 pmol/cell； BCB-組，3．51179，7．291422pmol/cell：BCB+組，5．044247，11．26002 pmol/cell）差異顯著（P<

6、0．05）；其中BCB+組較對照組和BCB-組中谷胱甘肽的濃度差異顯著（P<0．05）。試驗(yàn)結(jié)果表明成熟后卵母細(xì)胞中GSH濃度大約是未成熟前卵母細(xì)胞中GSH濃度的2倍，而且經(jīng)選擇后的BCB+組卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量更高，有利于胚胎的后期發(fā)育。 3．經(jīng)BCB染色后卵母細(xì)胞在成熟后的凋亡情況不一樣。其中BCB+組的成熟率、凋亡率（80．9%，6．4%）較對照組（60．2%，27．6%）、BCB-組（51．9%，38．6%）差異顯著（P<0

7、．05）。表明隨著卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的降低其凋亡率逐漸升高。 4．三種化學(xué)激活方法Ionomycin+6-DMAP、A23187+6-DMAP與乙醇+6-DMAP均能激活牛孤雌胚，使其發(fā)育；三種激活的方式均不能時(shí)間過長，以5 min效果較好，時(shí)間過長容易造成細(xì)胞碎裂；其中以Ionomycin+6-DMAP組激活效果較好。 5．試驗(yàn)表明BCB染色對未成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量的選擇以及培養(yǎng)體系對SCNT效果的影響。得出結(jié)論：牛卵母細(xì)胞

8、成熟培養(yǎng)前通過BCB染色可以選擇不同發(fā)育能力的卵母細(xì)胞，從而為IVM-IVF的研究和體細(xì)胞核移植的成功率提供高質(zhì)量的COCs；在核移植中，受體卵母細(xì)胞的選擇以卵母細(xì)胞成熟前進(jìn)行BCB染色為依據(jù)，以BCB+組作為受體卵母細(xì)胞，在成熟液中添加50 ng/mL EGF和100μmol/L，β-ME，在核移植后重組胚培養(yǎng)液中添加0．5 mmol/L HTAU，其囊胚率32．26%較對照組不進(jìn)行BCB染色不采用優(yōu)化培養(yǎng)體系提高了79．22%，表明