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1、諾如病毒(Noroviruses,NVs)是非細(xì)菌性腸胃炎的主要病原體,通過(guò)食品和水源傳播可以引起全球范圍的流行。流行病學(xué)調(diào)查提示雙殼軟體動(dòng)物是NVs最主要的傳播載體。近年來(lái),由于生食含有NVs的貝類等水產(chǎn)品引發(fā)的世界范圍的大規(guī)模腸胃炎疫情不斷暴發(fā),給消費(fèi)者健康造成了巨大威脅,也給水產(chǎn)行業(yè)帶來(lái)了重大損失。我國(guó)是貝類養(yǎng)殖大國(guó),系統(tǒng)研究NVs的檢測(cè)技術(shù),建立貝類水產(chǎn)品中NVs快速靈敏的定性、定量檢測(cè)方法,開(kāi)展水產(chǎn)品中Nvs污染狀況流行病學(xué)調(diào)
2、查,對(duì)于提供NVs檢測(cè)技術(shù),預(yù)防疫情暴發(fā)、減少漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要現(xiàn)實(shí)意義。 NVs目前尚不能體外培養(yǎng),變異多,鑒別和檢測(cè)非常困難,傳統(tǒng)的免疫學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)方法存在很大的局限性。逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)已經(jīng)成為定性檢測(cè)NVs的黃金法則,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)、實(shí)時(shí)序列特異性核酸體外擴(kuò)增(Real-time NASBA)等定量分子檢測(cè)技術(shù)在病毒載量檢測(cè)中已顯示出越來(lái)越多的優(yōu)勢(shì)。
3、 根據(jù)諾如病毒RNA聚合酶區(qū)保守序列,優(yōu)化了4對(duì)NVs引物的反應(yīng)體系,篩選了最適合于貝類樣品檢測(cè)的引物為JV13I/JV12Y。并且以此引物作為定性檢測(cè)方法,采用正交方法設(shè)計(jì)了9個(gè)實(shí)驗(yàn)組,充分考慮pH值、吸附劑和沉淀劑之間的交互關(guān)系,通過(guò)人工污染實(shí)驗(yàn),篩選出了一種富集濃縮貝類中NVs最優(yōu)方法,即在吸附緩沖液中性環(huán)境(pH7.5)下,以蘇氨酸作為吸附劑吸附兩次,9%PEG6000和7%的PEG8000各沉淀一次,此法病毒回收率可達(dá)
4、23%。 以SYBR GreenⅠ為染料,以攜帶NVs基因片段的高純質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,通過(guò)改變信號(hào)收集溫度,去除了大部分非特異性擴(kuò)增的干擾,建立了檢測(cè)貝類中NVs的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒量在108-103拷貝之間具有良好的線性關(guān)系,可以檢測(cè)到10-5稀釋度的病毒RNA,是常規(guī)RT-PCR法的100倍,方法操作簡(jiǎn)便,可以有效的節(jié)約時(shí)間、降低成本,取得較好的定量效果。 使用TaqMan探針?lè)?,通過(guò)SP
5、6酶體外轉(zhuǎn)錄成cRNA作為熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)品,建立了一步法TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,簡(jiǎn)化了操作步驟,消除了樣本處理與RT效率的不同對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性造成的差異,能夠最大限度提高貝類中NVs定量的可靠性,當(dāng)cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為108-102拷貝之間具有良好的線性關(guān)系,可以檢測(cè)到10-5稀釋度的病毒RNA,方法速度快,特異性好,為NVs快速準(zhǔn)確定量提供了技術(shù)支持。 自行設(shè)計(jì)了用于實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的引物和分子信標(biāo),初步建立了
6、基于Light Cycler2.0熒光定量?jī)x的NVs實(shí)時(shí)NASBA檢測(cè)方法,特異性好,靈敏度高于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,在cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為108-100拷貝間標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。據(jù)我們所知,使用Roche LightCycler2.0熒光定量?jī)x進(jìn)行NVs實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增的研究尚屬首次。本研究表明,實(shí)驗(yàn)室可以使用RocheLightCycler2.0實(shí)時(shí)定量?jī)x可以代替特殊的擴(kuò)增儀器成功的進(jìn)行實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增。 運(yùn)
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