番茄潰瘍病furA和katA基因突變體的構(gòu)建.pdf

1、番茄潰瘍病(Cmm)是番茄生產(chǎn)中最為嚴(yán)重、具有毀滅性的病害之一。該病自從1909年首次在美國密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來,現(xiàn)已廣泛分布于美國各番茄產(chǎn)區(qū),并逐漸成為世界性病害。目前番茄潰瘍病在我國北京、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、新疆、河南、河北、山西、山東、上海、海南等省、市、自治區(qū)都有發(fā)生,使許多地區(qū)番茄生產(chǎn)受到了不同程度的影響。有研究表明,furA基因與/katA基因可能與番茄潰瘍病原菌(Cmm)致病性相關(guān)。為驗證Cmm中furA基因與/

2、katA基因之間的相互關(guān)系,推測其致病機理,為抗病育種提供理論依據(jù),我們構(gòu)建了番茄潰瘍病furA和katA基因的不同缺失突變體,通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)入Cmm野生型菌株中,并分別進行了分子生物學(xué)檢測和生理指標(biāo)的檢測。
　　 以Cmm野生菌株的基因組DNA為模板,根據(jù)furA和katA基因序列的設(shè)計特異引物,進行PCR擴增反應(yīng)。PCR擴增產(chǎn)物電泳分析后,回收目的條帶,與pMD18-T載體連接,分別命名為Cmm1號,2號,3號,4

3、號片段和123-T。利用BamHⅠ位點,將經(jīng)過序列測定正確的目的片段從pMD18-T載體上酶切回收。用T4DNA連接酶分別連接1號和2號片段,3號和4號片段。之后通過PCR擴增對不同缺失片段加KpnⅠ接頭,回收目的條帶,連pMD18-T或pEASY-T1載體；利用KpnⅠ位點,將測序正確的目的片段從測序載體上酶切回收,用T4DNA連接酶連接分別獲得1234,12'3,12’34；上述片段PCR擴增加EcoRⅠ接頭,連pMD18-T或pE

4、ASY-T1載體經(jīng)EcoRⅠ酶切；同時將pHN216表達(dá)載體線性化,回收的條帶。將回收的EcoRⅠ酶切1234,12'3,12’34,123加EcoRⅠ接頭片段和pHN216載體片段用T4DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)中,挑取陽性克隆進行鑒定。隨后通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將上述鑒定正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入Cmm野生型菌株中。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中Fe2+濃度分別為0和0.5mM的情況下,Cmm野生菌株和各