大麥黃矮病毒運動蛋白在煙草中的瞬時表達及其功能研究.pdf

1、近些年來,隨著生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)研究的不斷深入,利用病毒載體在植物中表達外源基因已經(jīng)成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。隨著載體構(gòu)建策略的不斷完善,多種病毒已被用于構(gòu)建不同類型的載體,從而表達各種不同目的的外源基因,而最有價值的用途是用于商業(yè)化生產(chǎn)一些蛋白質(zhì)或多肽,尤其是利用植物病毒作為表達載體系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗或藥用蛋白。本研究中所利用的病毒載體是馬鈴薯X病毒載體(Potato virus X,PVX),它具有轉(zhuǎn)化途徑簡單、可快速

2、得到高拷貝的外源基因等優(yōu)點,因此,近年來無論在基礎(chǔ)研究上還是應(yīng)用研究上都得到了廣泛的重視。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達體系是一種在植物中快速、大量表達基因的實用系統(tǒng)。本研究運用了該系統(tǒng)以大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV)的運動蛋白(Movement Protein, MP)為研究對象,建立了以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和滲透注射技術(shù)為基礎(chǔ)的植物病毒載體介導(dǎo)的外源基因表達的技術(shù)體系,對外源基因的表達進行了初

3、步的檢測分析,并獲得了較好的實驗結(jié)果。研究以BYDV-PAV的全長cDNA為模板,根據(jù)Genebank中登記的BYDV-MP的基因序列設(shè)計引物,通過PCR擴增得到目的基因片段BYDV-MP,然后定向克隆到馬鈴薯X病毒載體pGR107上,得到了重組的馬鈴薯X病毒載體,然后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,利用農(nóng)桿菌滲透注射技術(shù)注射到煙草葉片,分析了外源基因BYDV-MP在植物體內(nèi)的瞬時表達狀況。
　　研究結(jié)果:農(nóng)桿菌滲透注射后第七天觀察,重組病毒載體

4、侵染的煙草系統(tǒng)葉有病毒侵染癥狀,而對照組未有此現(xiàn)象。對兩組實驗進行逐日跟蹤觀察,重組病毒載體侵染的煙草有較嚴重的病毒侵染癥狀和葉片卷曲現(xiàn)象,后期還會引起注射葉及系統(tǒng)葉的壞死。而空病毒載體侵染的煙草只有輕微的病毒侵染癥狀,并能夠恢復(fù)健康。對侵染的煙草作RT-PCR檢測,結(jié)果表明外源基因BYDV-MP在煙草體內(nèi)進行了正常的轉(zhuǎn)錄和表達。由此我們得出結(jié)論:(1)BYDV-MP蛋白促進了 PVX的系統(tǒng)侵染速度,加重了系統(tǒng)侵染的病毒癥狀,是病毒病癥

5、的決定因子;(2)由于BYDV-MP侵染導(dǎo)致煙草葉片卷曲、形態(tài)異常及生長抑制等現(xiàn)象,表明BYDV-MP影響了被侵染植株的正常發(fā)育,但是其作用的分子機制還有待進一步的實驗驗證;(3)此外,還驗證了利用PVX表達載體表達異源MP的方法是可行的。
　　本研究建立了馬鈴薯X病毒表達外源蛋白的技術(shù)體系,在野生煙草中表達了大麥黃矮病毒的運動蛋白基因,這為進一步研究BYDV的MP蛋白功能奠定了基礎(chǔ),同時也對應(yīng)用BYDV-MP蛋白基因介導(dǎo)的抗病毒