移動(dòng)蛋白調(diào)控ToMV在寄主中病毒積累量的分子機(jī)理.pdf

1、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是煙草花葉病毒屬(Tobamo virus)的典型成員，寄主范圍十分廣泛，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了研究ToMV在寄主植物中的致病機(jī)理，本論文構(gòu)建系統(tǒng)性表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的載體ToMV-GFP，研究移動(dòng)蛋白（Movement protein,MP）調(diào)控ToMV在煙草中基因組高含量積累的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:

2、
　　一、以ToMV為載體表達(dá)綠色熒光蛋白
　　以pCB301-ToMV-N5的農(nóng)桿菌侵染性克隆為骨架，通過PCR、酶切/連接等技術(shù)將病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)缺失，并以GFP代替，獲得重組克隆pCB301-ToMV-N5CP45GFP。農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種本氏煙的結(jié)果表明，該載體高效表達(dá)GFP，農(nóng)桿菌接種濃度(OD600)為0.002時(shí)，GFP也能夠有效表達(dá)。由于病毒缺失CP導(dǎo)致病毒不能移動(dòng)至寄主非接種部位，

3、我們將TMGMV-U5的包含CP的大小為647nt(5498-6145nt)片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中，得到pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5，浸潤(rùn)接種的結(jié)果表明，其能系統(tǒng)性移動(dòng)，在煙草的非接種葉中GFP大量表達(dá)。
　　二、ToMV的移動(dòng)蛋白提高病毒在寄主上的積累
　　本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建pCB301-ToMV-N5、pCB301-ToMV-S1和MP互換的嵌合重組病毒pCB301-

4、ToMV-N5MPS1、pCB301-ToMV-S1MPN5的農(nóng)桿菌侵染性克隆，番茄和本氏煙浸潤(rùn)接種結(jié)果顯示ToMV-N5株系的MP可提高病毒在寄主中的含量。系統(tǒng)性侵染本氏煙的ToMV-GFP的結(jié)果表明，在接種葉和系統(tǒng)葉中，ToMV-N5CP45GFP-CPU5的含量高于ToMV-N5MPS1CP45GFP-CPU5（MP由ToMV-S1的MP替代），在病毒接種的12天，二者在寄主的病毒含量上沒有明顯的差異;同樣ToMV-S1CP45G

5、FP-CPU5的GFP含量低于ToMV-S1MPN5CP45GFP-CPU5（MP由ToMV-N5的MP替代），病毒接種12天時(shí)病毒含量無明顯差異。ToMV瞬時(shí)表達(dá)GFP的結(jié)果也表明ToMV-N5的MP能提高ToMV-S1在寄主中的病毒積累量。
　　為了進(jìn)一步研究ToMV-N5的MP提高病毒含量的作用機(jī)制，通過構(gòu)建p35S-N5MP和p35S-S1MP瞬時(shí)表達(dá)載體。將p35S-MP與ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MP

6、S1CP45GFP以及ToMV-N5MPSFCP45GFP（MP發(fā)生移碼突變）組合后接種本氏煙，結(jié)果顯示ToMV的MP蛋白確實(shí)影響病毒在寄主中的含量積累且ToMV-N5的MP作用較ToMV-S1的顯著。沉默抑制子活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)表明，ToMV-N5的MP提高病毒的含量不是以基因沉默抑制子調(diào)控寄主來實(shí)現(xiàn)的。將ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MPS1CP45GFP菌液濃度稀釋5000倍后接種本氏煙發(fā)現(xiàn)2個(gè)株系的MP對(duì)病毒細(xì)胞間移動(dòng)

7、效率無明顯影響，因此ToMV-N5提高病毒含量與病毒的細(xì)胞-細(xì)胞間移動(dòng)無關(guān)。
　　三、MP定位在寄主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并形成大的包涵體
　　將ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MPS1CP45GFP和p35S-N5MP、p35S-S1MP組合后混和接種本氏煙，病毒接種后2和3天，顯微鏡下觀察病毒的侵染點(diǎn)結(jié)果表明N5MP和S1MP均能提高ToMV-N5MPS1CP45GFP在煙草葉片中產(chǎn)生侵染點(diǎn)的數(shù)量，并且前者比后者的效果更明