中國小麥花葉病毒運動蛋白基因的克隆、表達及其酵母雙雜交篩選研究.pdf

1、本研究根據(jù)Diao等(1999)發(fā)表的CWMV的RNA1全序列設計特異性表達引物，應用RT-PCR技術從小麥病葉中擴增得到長約1kb的DNA片段。將其克隆至載體pGEM-T，序列分析表明成功獲得全長MP基因。開放閱讀框架包括990個核苷酸，編碼329個氨基酸，與已報道的CWMV基因組相應核苷酸序列(EMBL登錄號：AJ012005)同源性為99.6％。將MP基因亞克隆至原核表達載體構建重組質粒pSBET-MP，SDS-PAGE分析表明，

2、轉有pSBET-MP的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS高效表37kDa蛋白，與MP基因閱讀框架的理論推算值37.4kDa相符。并以含表達產(chǎn)物的凝膠為抗原，按常規(guī)方法免疫小鼠，免疫三次后第三天斷頭收集血清。Westernblot分析表明制得的抗血清是針對MP的多抗，并且具有很強的專一性。ELISA測定其效價約為1：1200。　　用Trizol提取小麥總RNA后并將其純化成mRNA，應用SMART技術合成第一鏈cDNA。然后用5’和3

3、’PCR引物進行LD-PCR擴增，合成雙鏈cDNA，并與pGADT7-Rec一起轉化酵母菌AH109，構建小麥的酵母雙雜交cDNA文庫。　　將MP基因重組到質粒pGBKT7中，構建酵母雙雜交載體pGBKT7-MP，電擊轉入酵母菌Y187。Westernblot分析表明MP基因在酵母體內能正確表達具有免疫活性的融合蛋白，并排除對宿主細胞的毒害和自激活作用，可作為酵母雙雜交系統(tǒng)中的“誘餌”質粒?！　±媒湍妇鶼187(MATα型)和AH