苧麻花葉病毒的分子鑒定及序列克隆.pdf

1、苧麻花葉病是苧麻上的嚴(yán)重病害，其病毒是苧麻花葉病毒。雖然國(guó)內(nèi)有人研究了苧麻花葉病毒的生物學(xué)特性，但對(duì)于其病原，分類地位和基因組結(jié)構(gòu)方面的研究很少。為了解決這些問題，我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定，為后續(xù)的研究打下了基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所種質(zhì)圃引種具有典型苧麻花葉病癥狀的苧麻品種，移植到海南。采集具有典型癥狀的苧麻葉片，通過高速和超速離心結(jié)合的方法進(jìn)行苧麻花葉病毒的提純。對(duì)病毒提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在膠

2、上有一相對(duì)分子量大約為33kDa的蛋白條帶，此條帶對(duì)照里沒有，推測(cè)其為苧麻花葉病毒的外殼蛋白；對(duì)病毒的提取液用蛋白酶K消化法同時(shí)提取病毒和對(duì)照核酸，電泳檢測(cè)到一對(duì)照沒有的條帶，同時(shí)對(duì)用進(jìn)行分光光度計(jì)測(cè)病毒核酸的含量，結(jié)果顯示其核酸主要有ssDNA組成。 為進(jìn)一步研究病毒的基因組結(jié)構(gòu)，利用雙生病毒的簡(jiǎn)并引物PA和PB及另一對(duì)通用引物Fr11和Fr12以提取的病毒核酸為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。分別擴(kuò)出大約500bp和1200bp的片段，轉(zhuǎn)化

3、并測(cè)序。再根據(jù)測(cè)出的序列設(shè)計(jì)引物Fa1，F(xiàn)a2和Ffbaf，F(xiàn)lbar，擴(kuò)增2500bp和2700bp全長(zhǎng)。將回收的2500bp和2700bp片段轉(zhuǎn)化，篩選出重組質(zhì)粒Fa-6和Ffba-8，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)a-6為begomovirusesDNA-A組分，其全長(zhǎng)為2738bp;Ffba-8為begomovirusesDNA-A組分，其全長(zhǎng)為2708bp。對(duì)病毒的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究表明，其DNA-A基因組結(jié)構(gòu)具有典型的菜豆金色花葉

4、病毒的特點(diǎn)，共編碼6個(gè)開放閱讀框(openreadingframes,ORFs)，其中病毒鏈編碼AV1和AV2兩個(gè)ORFs，互補(bǔ)鏈編碼ACI(Rep)、AC2，AC3和AC4四個(gè)ORFs;基因間隔區(qū)含有雙生病毒所共有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、保守的9核苷酸序列、TATA盒和三個(gè)不完全重復(fù)序列，這些結(jié)構(gòu)都是雙生病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄起始和包裝所必需的；基因組DNA-B編碼2個(gè)ORFs，包括病毒鏈編碼的BV1和互補(bǔ)鏈編碼的BC1。病毒的BV10RF(866～16

5、96)編碼病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白，互補(bǔ)鏈上的BClORF(1710～2585)編碼核穿梭蛋白。而由相似性分析得知，組分DNA-A與中國(guó)番茄曲葉病毒福建分離株及臺(tái)灣分離株的基因組組分DNA-A相似性最高，都為95％，與ToLCV-[China:Fujian:2005]的外殼蛋白相似性達(dá)到96％；組分DNA-B與與辣椒黃曲葉病毒的基因組DNA-B相似性最高，為76％。應(yīng)用生物學(xué)軟件MEGA3.0中的鄰接法對(duì)全長(zhǎng)核苷酸進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其DNA-A組