TGEV-PRCV鑒別診斷方法的建立及TGEVN蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis, TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的一種高接觸性傳染病，主要引起一周齡以下仔豬發(fā)生嘔吐、水樣腹瀉和死亡（死亡率通常為100％）。豬傳染性胃腸炎流行遍布全世界，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory c

2、oronavirus, PRCV）是TGEV的基因缺失變異株，其與TGEV核苷酸序列同源性達(dá)96％。TGEV和PRCV基因結(jié)構(gòu)十分相似，抗原相關(guān)，產(chǎn)生的中和抗體有交叉反應(yīng)，傳統(tǒng)血清學(xué)方法很難將二者區(qū)分開。PRCV與TGEV相比，其S基因5’末端有大量堿基缺失，不同PRCV毒株的堿基缺失情況各不相同，缺失從621～681個(gè)堿基不等，并導(dǎo)致PRCV失去兩個(gè)抗原位點(diǎn)。目前，各國(guó)PRCV感染現(xiàn)象呈現(xiàn)日益嚴(yán)重的趨勢(shì)，并且常在TGEV感染豬群中發(fā)生

3、，造成TGEV血清轉(zhuǎn)陽現(xiàn)象，因此建立一種TGEV與PRCV的鑒別診斷方法尤其重要。
　　 本研究根據(jù)已發(fā)表的PRCV基因組序列中的S基因序列和本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的TGEV華毒弱毒株的S基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，在S基因缺失區(qū)兩端分別設(shè)計(jì)了兩套引物P1、P2、P3、P4，以TGEV和PRCV細(xì)胞培養(yǎng)物為材料提取RNA，進(jìn)行套式RT-PCR特異性片段擴(kuò)增，TGEV P1、P2擴(kuò)增片段大小為1338bp，P3、P4擴(kuò)增片段大小為936bp，PR

4、CV擴(kuò)增片段分別為717bp、315bp。經(jīng)過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化后建立的套式RT-PCR方法經(jīng)過特異性、敏感性試驗(yàn)檢測(cè)，只有TGEV與PRCV有特異性條帶被擴(kuò)增出，其他病毒（PEDV、PRRSV、SIV、PRoV、PRV、HCV）均未擴(kuò)增出特異條帶，TGEV與PRCV病毒最低檢測(cè)量均為4 TCID50/mL，證明本法具有快速、特異和高度敏感的特點(diǎn)。
　　 本研究還設(shè)計(jì)建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法用來鑒別區(qū)分TGEV與PRCV。根據(jù)已發(fā)表的

5、PRCV基因組序列中的S基因序列和本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的TGEV華毒弱毒株的S基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，在S基因缺失區(qū)和共同區(qū)分別設(shè)計(jì)一套引物Q-FIP、Q-BIP、Q-F3、Q-B3與QX-FIP、QX-BIP、QX-F3、QX-B3，以TGEV與PRCV細(xì)胞培養(yǎng)物為材料提取RNA，進(jìn)行特異性LAMP片段擴(kuò)增，其中TGEV在Q系列引物擴(kuò)增下會(huì)出現(xiàn)典型的LAMP梯度條帶，Q系列引物擴(kuò)增最小帶為184bp，而PRCV在QX系列引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)條帶，片段

6、大小194bp。經(jīng)過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化后建立的LAMP方法經(jīng)過特異性、敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，只對(duì)TGEV與PRCV擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，而其他病毒（PEDV、PRRSV、PRoV）無條帶出現(xiàn)，均為陰性。此方法可檢測(cè)到的TGEV與PRCV病毒最低量為0.1TCID50/mL。證明本法具有快速、特異和高度敏感的特點(diǎn)。本方法采用美萊博公司的熒光染料SmartGreenⅠ與MgCl2進(jìn)行肉眼及熒光可視檢測(cè)，可以很容易的區(qū)分出陰陽性反應(yīng)，方便現(xiàn)地檢測(cè)病料。
　

7、　 上述兩種方法的建立可以很好地鑒別診斷和區(qū)分TGEV與PRCV病毒，并且兩種方法的特異性和敏感性都很高，相比較起來RT-LAMP方法比套式RT-PCR方法更敏感，且更適于現(xiàn)地病料檢測(cè)。
　　 本研究采用原核表達(dá)的TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，間接ELISA方法進(jìn)行篩選，抗原為TGEV N蛋白。采用有限稀釋法，經(jīng)過四次克隆，最終獲得三株抗TGEV N蛋白的雜交瘤細(xì)胞株（1A9、1G7、1H8）。

8、三株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體亞型均為IgG1型，雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和凍存均未影響抗體的分泌。間接ELISA檢測(cè)1A9、1G7、1H8細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)分別為1:640、1:320、1:800，腹水抗體效價(jià)分別為1:6400、1:6400、1:12800 。用獲得的單克隆抗體和SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，感染TGEV的ST細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，熒光二抗孵育作用后，與單克隆抗體作用的細(xì)胞培養(yǎng)物中，多數(shù)細(xì)胞在其

9、胞漿和細(xì)胞膜上出現(xiàn)強(qiáng)熒光，與SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清作用未見出現(xiàn)熒光，結(jié)果表明，利用所制備的單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光對(duì)病原檢測(cè)具有較高的特異性。用單克隆抗體與TGEV和TGEV N蛋白進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)：熒光素二抗作用后用紅外熒光掃描成效系統(tǒng)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)只在TGEV N蛋白處出現(xiàn)特異性條帶，而TGEV病毒其他蛋白處未有特異性條帶出現(xiàn)。結(jié)果說明，利用所制備的單克隆抗體進(jìn)行westernblot對(duì)病原檢測(cè)具有較高的特異性。