產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌toxA基因克隆、表達及表達蛋白生物學特性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌(toxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)是豬進行性萎縮性鼻炎(Swineprogressiveatrophicrhinitis,PAR)的主要病原菌。該菌分泌產(chǎn)生的多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin,PMT)是一種約146kDa的皮膚壞死毒素。該毒素由toxA基因編碼,是T+pm的主要致病因子。PMT有很強的致病性,只注射少量提純的PMT就可以復制PA

2、R。鑒于PMT在PAR的產(chǎn)生過程中所起的重要作用,有關PMT的檢測便成為檢測PAR的關鍵。PMT的N端是粘附位點,C端是催化位點,中間區(qū)域為跨膜區(qū),雖然PMT具有很強的致病性,但是部分缺失的PMT蛋白可以失去其致病性而保留免疫原性,這對于PAR疫苗的研制具有重要的意義。 本研究針對T+Pm的toxA基因及其表達產(chǎn)物開展了以下工作: 1、參照GenBank已發(fā)表的toxA基因序列,分別設計了針對T+PmtoxA基因及其3`

3、端的2對寡核苷酸引物。以本實驗室分離保存的T+Pm菌株HN-13為實驗材料,用PCR的方法成功擴增toxA基因的全序列及其3`端基因片段C2115。對toxA基因的PCR產(chǎn)物進行序列測定,結果表明:該片段共4019bp,ORF為3858bp(登陸號:AY864768);與GenBank上所報道的toxA基因序列核苷酸同源性都在99.8%以上。將擴增的基因插入原核表達載體pGEX-KG,成功構建了重組質(zhì)粒pGEX-toxA。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)誘導獲得大小約173kDa的表達蛋白(rPMT)。Westernblot檢測表明,表達蛋白具有良好的反應原性。動物試驗表明,以表達蛋白免疫的昆明小鼠,可以抵抗天然毒素致死劑量的攻擊。 2、為了更好的研究毒素蛋白的生物學活性,在所克隆的toxA基因的基礎上,用酶切的方法獲得了5個亞克隆片段:N1518、N3172、C2345、C2693和C3388。將上述5個基因片段和3’端基因片段C21

5、15插入pET-28a(b,c)載體系統(tǒng),分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),誘導表達。結果pET28b-C2115和pET28a-N1518重組質(zhì)粒獲得了高效表達,分別表達了toxA5’端的1518個堿基和3’端基因的2115個堿基。表達蛋白的大小分別約57kDa(rPMT-N)和78kDa(rPMT-C),Westernblot檢測表明,兩種表達蛋白具有良好的反應原性。 3、分別以rPMT-N和rPMT-C免疫大白兔,連續(xù)免

6、疫5次,每次間隔10d,并用瓊脂雙向擴散試驗檢測效價。結果,rPMT-N抗血清效價達1/32,rPMT-C抗血清效價達1/16。 4、以rPMT-N和rPMT-C的混合物為抗原,初步建立一種檢測PMT抗體的間接ELISA方法。經(jīng)方陣滴定確定抗原最佳包被濃度為1.6μg/mL、血清最佳稀釋倍數(shù)為1:40,陰陽性界限為OD630=0.291;用該方法檢測608份臨床送檢血清,結果表明陽性率達69.6%。 5、以rPMT、rP

7、MT-N、rPMT-C、及rPMT-N和rPMT-C的混合物分別與滅活的T+Pm(3.3×108個/mL)和支氣管敗血波氏桿菌(5×108個/mL)輔以白油乳化制成類毒素菌苗,并以該疫苗免疫本動物試驗。檢測結果初步顯示,rPMT-N和rPMT可以用于制備PAR疫苗。 6、以我們實驗室保存的T+Pm菌株HN-13為材料,繪制細菌生長曲線。結果表明,接種后3h進入對數(shù)生長期;7h時進入穩(wěn)定期;并于15h時逐漸轉(zhuǎn)入衰亡期。 本

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