牛源多殺性巴氏桿菌PlpB、OmpH和OmpA重組蛋白的表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、在養(yǎng)牛生產(chǎn)中，牛出?。╤emorrhagic septicemia of cattle）是一種很重要的急性、接觸性和敗血性傳染病，由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)引起，這種致病菌具有條件性致病特征。某些情況下，牛感染Pm后會(huì)發(fā)展成為肺炎。由于廣泛流行這種疾病，我國的養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)受到極為嚴(yán)重的影響。目前國內(nèi)還未研發(fā)出行之有效的Pm的疫苗，這種細(xì)菌異型之間的交叉保護(hù)性極低，無法對Pm進(jìn)行有效的防控。因此，需要

2、研發(fā)能夠提供交叉保護(hù)性并且安全有效的新疫苗。
　　從目前的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白OmpA和OmpH，以及脂蛋白PlpB是具有抗原性的，并且 OmpH蛋白作為細(xì)菌成孔蛋白（porin）可優(yōu)先識別疏水性物質(zhì)，親和力很高，具有參與免疫啟動(dòng)的重要作用。OmpA是一種具有相對保守性與免疫原性的膜蛋白，可粘附于細(xì)胞外基質(zhì)激發(fā)動(dòng)物機(jī)體的體液免疫與細(xì)胞免疫。PlpB蛋白位于Pm細(xì)胞的外表面，能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有一定的血清間的交叉保護(hù)性

3、。因此對這三個(gè)蛋白進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和基因的擴(kuò)增，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，最后通過小鼠的攻毒免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)重組蛋白的免疫保護(hù)效果，具體研究工作如下：
　　1.提取高純度Pm基因組,擴(kuò)增基因PlpB、OmpA和OmpH，然后先構(gòu)建到pMD-18T上。經(jīng)酶切鑒定，構(gòu)建成功的質(zhì)粒送公司測序。在NCBI上對測序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果顯示構(gòu)建到載體上的基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需要的目的基因，對目的基因序列進(jìn)行簡單的分析。
　　2.將基因Plp

4、B、OmpA和OmpH構(gòu)建到PET-32A載體上，酶切鑒定成功送公司測序并對測序結(jié)果進(jìn)行比對驗(yàn)證。若質(zhì)粒上的目的基因未發(fā)生突變，將構(gòu)建成功的PET-32A-OmpA/OmpH/PlpB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌BL21的菌體內(nèi)，進(jìn)行蛋白的表達(dá)驗(yàn)證。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證后重組蛋白OmpA和OmpH表達(dá)在包涵體。包涵體蛋白用8mol/L的尿素（含有50nmol/L的Tris）溶解變性，通過透析來逐漸降低尿素濃度，使重組蛋白復(fù)性可溶；重組蛋白PlpB表達(dá)在菌

5、體上清，此蛋白純化則通過His標(biāo)簽Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化，用SDS-PAGE進(jìn)行電泳、染色和脫色觀察到目的蛋白大小位置有清晰條帶，雜帶較少。又經(jīng)過Western-blot檢測確定純化到的確為重組目的蛋白。將純化后的蛋白進(jìn)行濃縮，根據(jù)在酶標(biāo)儀上測得的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，計(jì)算結(jié)果顯示蛋白量達(dá)到制備疫苗的要求。用全菌免疫的小鼠陽性血清，對重組蛋白進(jìn)行抗原特異性檢測，結(jié)果表明 PlpB、OmpA和 OmpH都具有抗原性。
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6、.純化后的重組蛋白與滅活的全菌加入佐劑乳化后制備成疫苗，然后對小鼠進(jìn)行免疫，并且設(shè)置空白對照。免疫兩次，中間間隔兩周。免疫后兩周采血，取血清后用ELISA的方法檢測抗體。結(jié)果顯示重組蛋白疫苗組的抗體水平明顯高于空白組。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白疫苗組保護(hù)率較低，但重組蛋白疫苗組的小鼠存活時(shí)間相對明顯延長，并且，全血?dú)⒕鷮?shí)驗(yàn)與組織載菌量的結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)的血清抗體有明顯抑制多殺性巴氏桿菌增長的作用，說明重組蛋白OmpA、OmpH和Plp