多殺性巴氏桿菌跨膜輸出蛋白基因選擇克隆載體的構(gòu)建和應(yīng)用.pdf

1、在己構(gòu)建pMBL載體的基礎(chǔ)上，參照Lac啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒puC18上擴(kuò)增出260bp大小的片段，定向克隆入pMBL載體，獲得含可調(diào)控啟動(dòng)子(Plac)的跨膜輸出蛋白基因選擇克隆載體pMB-Lac，大小為3.72kb。參照Ara啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，從Ecoli基因組上擴(kuò)增出阿拉伯糖啟動(dòng)子及其調(diào)控基因，定向克隆入pMBL載體，構(gòu)建成另一個(gè)跨膜輸出蛋白基因選擇克隆載體pMB-Ara，大小為4.74kb。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序，證明構(gòu)建的載

2、體與預(yù)期設(shè)計(jì)的一致。 為證明pMB-Lac/pMB-Ara 2個(gè)跨膜輸出蛋白基因選擇克隆載體的有效性，從質(zhì)粒pBR322上PCR擴(kuò)增缺失啟動(dòng)子的已知跨膜輸出蛋白基因---四環(huán)素抗性基因片段(APTet，315bp)，EcoR Ⅰ/BamHⅠ雙酶切末端，分別與用EcoR Ⅰ/BamHⅠ、EcoR Ⅰ/Bgl Ⅱ、EcoR Ⅰ/Bcl Ⅰ雙酶切的載體連接。經(jīng)Kan+Amp+IPTG/Kan+Amp+Arabinose平板篩選，在Ec

3、oR Ⅰ+BamH Ⅰ雙酶切載體(+2位)的連接產(chǎn)物中獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)酶切和測(cè)序確認(rèn)△P Tet基因已以閱讀框?qū)ξ坏姆绞讲迦?，Lac/Ara啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了△P Tet基因和報(bào)告基因(△P△SP Amp)的融合表達(dá)和跨膜分泌。 為評(píng)估載體骨架上MCS上游啟動(dòng)子或潛在的啟動(dòng)子對(duì)克隆基因的漏表達(dá)影響，將△P Tet基因片段克隆到不含啟動(dòng)子的原始質(zhì)粒pMBL，構(gòu)建pMBL △PTet陰性對(duì)照質(zhì)粒，結(jié)果轉(zhuǎn)化子在Kan平板中生長(zhǎng)，而在A(yíng)mp

4、+Kan平板上無(wú)論是否誘導(dǎo)或使用何種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)僅在A(yíng)mp 16(濃度單位為mg/L)時(shí)有少量生長(zhǎng)。為探討pMB-Lac/pMB-Ara 2個(gè)載體中的Lac和Ara啟動(dòng)子的可調(diào)控范圍、漏表達(dá)的程度及誘導(dǎo)的最適條件，對(duì)構(gòu)建的pMB-Lac△PTet、pMB-Ara△PTet載體的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行不同誘導(dǎo)劑及濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，并使用不同的Amp濃度進(jìn)行篩選，為排除△PTet在去除啟動(dòng)子時(shí)對(duì)其SD序列可能造成的破壞，用T7-SD序列直接與Tet基因編碼

5、區(qū)拼接，構(gòu)建了pMB-L,acAPT7-Tet質(zhì)粒，并與pMB-Lac△PTet進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果pMB-Lac△PTet和。pMB-Lac△PT7-Tet的轉(zhuǎn)化子經(jīng)1.5mM的IPTG誘導(dǎo)在A(yíng)mpl6、32、64平板中均有一定程度的生長(zhǎng)，相比較相同條件下帶T7-SD序列的轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)優(yōu)于帶Tet-SD序列的轉(zhuǎn)化菌。pMB-Ara△PTet轉(zhuǎn)化子在0.5％ 的阿拉伯糖誘導(dǎo)下在A(yíng)mp 16、32、64、128平板上均生長(zhǎng)良好，但細(xì)菌生長(zhǎng)

6、速度慢于在對(duì)照平板上的生長(zhǎng)速度；應(yīng)用不同濃度的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果用1.25％的濃度誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)菌在A(yíng)mp50平板上與在對(duì)照的Kan平板上菌落數(shù)相近；而用0.3-1.25％和1.25.10％濃度的阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)菌菌落數(shù)均較1.25％的濃度誘導(dǎo)時(shí)低。應(yīng)用無(wú)抗性液體培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接傳代10次和20次，分析了構(gòu)建的重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示質(zhì)粒丟失不明顯，質(zhì)粒骨架穩(wěn)定。進(jìn)一步選擇pMB-Ma，載體試用于多殺性巴氏桿菌C48-19菌株的外

7、膜蛋白基因的克隆。提取細(xì)菌的基因組DNA，用Sau 3A Ⅰ部分酶切，回收800bp-1kb的部分酶切片段，并與用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ/BgkⅡ、EcoR Ⅰ/BclⅠ雙酶切的pMB-Ara載體連接，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別用Amp+Kan平板和Amp+Kab+1.25％abinose平板篩選。于A(yíng)mp+Kan平板上挑取克隆子，PCR擴(kuò)增出插入的膜蛋白基因片段，并混合，標(biāo)記為探針，與Amp+Kan+1.25％arabinose平

8、板上獲得的克隆子雜交，篩選到5個(gè)表達(dá)差異的克隆(為62<'＃>、88<'＃>、89<'＃>、107<'＃>和108<'＃>克隆)?？烧T導(dǎo)性驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了88＃克隆在A(yíng)mp+Kan平板中不生長(zhǎng)而在A(yíng)mp+Kan+1.25％arbinose平板中生長(zhǎng)，推斷88<'＃>克隆的Amp活性是由載體所帶的Ma啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的，而19<'＃>克隆在兩種平板中均能生長(zhǎng)，表現(xiàn)為組成型表達(dá)的特點(diǎn)。 序列測(cè)定、BLAST同源查找以及SigalP信

9、號(hào)肽預(yù)測(cè)等結(jié)果顯示，88<'＃>克隆外源插入片段全長(zhǎng)827bp，含有完整的啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)，且與多殺性巴氏桿菌Pm70的atr1基因高度同源，推測(cè)該基因的啟動(dòng)子為E.coli中沉默的啟動(dòng)子，可能只在特殊誘導(dǎo)條件下才開(kāi)放。而19<'＃>克隆子克隆834bp的基因片段，對(duì)應(yīng)于一功能未知的unknown基因(PM0741基因，784aa)，為組成型表達(dá)的跨膜蛋白基因。該載體系統(tǒng)能有效地用于病原菌膜蛋白基因的選擇克隆。 該載體系統(tǒng)的建立，