綠色熒光蛋白在雞源乳酸桿菌中的表達(dá)及該重組菌口服后在小腸中的分布.pdf

1、為了探索乳酸桿菌在胃腸道中的分布情況及與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，本研究選用六株從雞胃腸道分離的乳酸桿菌作為綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)載體。這六株乳酸桿菌分別是果糖乳桿菌C2、德氏乳桿菌德氏亞種C12、腸乳桿菌D2、嗜淀粉乳桿菌D14、德氏乳桿菌乳亞種D17和嗜酸乳桿菌K9。本研究首先構(gòu)建含有綠色熒光蛋白基因(green fluorescent protein gene，gfp)的重組

2、質(zhì)粒，然后將其電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌。成功獲得表達(dá)GFP的果糖乳桿菌C2(C2-GFP)和德氏乳桿菌乳亞種D17(D17-GFP)，C2-GFP和D17-GFP在無(wú)抗生素壓力選擇情況下，連續(xù)培養(yǎng)10代，GFP在D17和C2中均獲得穩(wěn)定表達(dá)。最后將上述重組D17-GFP服接種雞，觀察其在消化道中的分布。整個(gè)試驗(yàn)分為兩部分： 第一部分：構(gòu)建含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化雞胃腸宿主乳酸桿菌。根據(jù)質(zhì)粒pRV85的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物P1、

3、P2，以pRV85為模板，PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增得到包含啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因pldhL-gfp片斷。該片斷分別經(jīng)ApaI和C／a I酶切后，克隆到大腸桿茵和乳酸桿菌的穿梭質(zhì)粒pLEM415中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，從DH5α中提取重組質(zhì)粒pLEM415：gfP，再將pLEM415：gfP電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌。提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明gfP成功轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中，在不同的電擊條件下，乳酸

4、桿菌的轉(zhuǎn)化效率有所不同。熒光顯微鏡下可觀察到重組乳酸桿菌發(fā)出綠色熒光，且gfP在乳酸桿菌中得到了穩(wěn)定的表達(dá)。該乳酸桿菌可用于活體觀察細(xì)菌的分布和活動(dòng)。 第二部分：給雞口服重組乳酸桿菌D17-GFP，觀察該乳酸桿菌在胃腸道中的分布。在獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的德氏乳桿菌乳亞種D17(D17-GFP)菌株后，口服接種二十日齡的雞，于接種后1.5、6、12、24、48和72h分別取胃腸內(nèi)容物接種培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，同時(shí)取胃、空腸、回腸和盲腸做