酯酶在錦鈴蟲氰戊菊酯和久效磷抗性中的作用.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae)屬鱗翅目夜蛾科害蟲,廣泛分布在南緯40°至北緯40°之間。棉鈴蟲食性雜,寄主包括棉花、玉米、小麥、蔬菜等多種農(nóng)作物,在亞洲、大洋洲、非洲和歐洲均有為害報(bào)道。在防治棉鈴蟲的過(guò)程中,大量使用殺蟲劑,世界各地相繼報(bào)道棉鈴蟲對(duì)有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類及擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。在棉鈴蟲對(duì)擬除蟲菊酯的抗性機(jī)理中,大量研究集中于細(xì)胞色素P4

2、50介導(dǎo)的氧化解毒代謝。在棉鈴蟲對(duì)有機(jī)磷的抗性機(jī)理中,解毒代謝增強(qiáng)及乙酰膽堿酯酶敏感性下降的相對(duì)作用還不清楚。有關(guān)酯酶在棉鈴蟲對(duì)擬除蟲菊酯及有機(jī)磷抗性中的作用還缺乏深入研究。
　　 本文通過(guò)對(duì)抗性品系中活性升高的酯酶同工酶進(jìn)行分離純化及質(zhì)譜鑒定,系統(tǒng)研究了酯酶在棉鈴蟲氰戊菊酯抗性中的作用。結(jié)果表明棉鈴蟲氰戊菊酯抗性涉及到多個(gè)CCE001家族基因,且抗性品系中CCE001家族酯酶基因在解毒代謝組織中的過(guò)量表達(dá)與棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相

3、關(guān)。酯酶在棉鈴蟲對(duì)久效磷的抗性中也起著重要作用。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相關(guān)酯酶同工酶的分離純化及對(duì)氰戊菊酯的離體水解
　　 棉鈴蟲氰戊菊酯抗性品系YGF3齡幼蟲的酯酶活性是敏感品系SCD的1.9倍,同時(shí)在YGF品系中存在更多具有高酯酶活性的個(gè)體。YGF品系與SCD品系酯酶Native PAGE圖譜也有差異,特別是遷移率為0.4和0.35兩個(gè)區(qū)域的酯酶同工酶(以下命名為A組和B組)顯現(xiàn)出染色強(qiáng)度的

4、顯著不同。在YGF品系中A組酯酶的染色強(qiáng)度是SCD品系的4.9倍,B組是SCD品系的12.7倍。YGF品系中這兩組酯酶同工酶都能水解氰戊菊酯類似物,但在SCD品系的相同區(qū)域幾乎沒有染色反應(yīng)。A組及B組酯酶活性升高可能與棉鈴蟲對(duì)氰戊菊酯的抗性有關(guān)。
　　 利用離心、硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過(guò)濾層析及離子交換層析技術(shù)對(duì)YGF品系中A組和B組酯酶同工酶進(jìn)行分離純化。A組酯酶純化倍數(shù)達(dá)50倍,回收率為0.13％。A組酯酶的純化產(chǎn)物在酯酶Na

5、tive-PAGE上顯現(xiàn)為一條主要的同工酶帶,在SDS-PAGE上顯現(xiàn)為一條主要蛋白帶,分子量約為60kDa。這是真核生物典型的單聚體羧酸/膽堿酯酶分子。純化后的A組及B組酯酶均可離體水解氰戊菊酯,A組酯酶水解氰戊菊酯更迅速。
　　 2.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相關(guān)酯酶同工酶的質(zhì)譜鑒定及基因克隆
　　 通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用鑒定出A組酯酶蛋白含有四種同工酶,分別為CCE001a、-d、-i和j,其中CCE001a在A組酯酶中蛋白豐度最高

6、。在YGF和SCD品系中擴(kuò)增了CCE001a,-d,-i和-j基因的全長(zhǎng)cDNA,四個(gè)酯酶基因由堿基序列推導(dǎo)的氨基酸序列都含有維持酯酶功能的催化三聯(lián)體及氧陰離子洞,屬于羧酸酯酶。四個(gè)酯酶基因編碼的氨基酸序列在YGF及SCD品系間都存在一些差異,這些差異可能是氨基酸多態(tài)性而與棉鈴蟲菊酯抗性無(wú)關(guān)。
　　 3.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性和敏感品系CCE001家族酯酶基因轉(zhuǎn)錄水平的比較
　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)YGF和SCD品系

7、中CCE001a,-d,-i和-j的轉(zhuǎn)錄水平。四個(gè)CCE001家族酯酶基因在YGF品系中腸及脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平均高于SCD品系,特別是豐度最高的CCE001a酯酶,其在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平是敏感品系的90倍。抗性品系YGF中CCE001家族酯酶基因在解毒代謝組織中的過(guò)量表達(dá)與YGF品系對(duì)氰戊菊酯的抗性有關(guān)。
　　 4.酯酶在棉鈴蟲久效磷抗性中的作用
　　 相對(duì)SCD敏感品系,室內(nèi)篩選的棉鈴蟲久效磷抗性品系A(chǔ)YR對(duì)久效磷的抗

8、性達(dá)到137倍。DEF對(duì)久效磷的增效作用達(dá)到27倍,PBO及DEM沒有明顯增效作用。AYR品系中非特異性酯酶的活力是SCD敏感品系的1.4倍,且差異達(dá)到顯著水平。兩品系間多功能氧化酶及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性差異不顯著。因此,酯酶活性升高可能是棉鈴蟲AYR品系對(duì)久效磷產(chǎn)生抗性的主要機(jī)理。
　　 5.棉鈴蟲久效磷抗性和敏感品系乙酰膽堿酯酶生化特性及基因克隆
　　 在AYR和SCD品系中,久效磷對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制中濃度(Ⅰ5

9、0)分別是0.011和0.007 mg·ml-1(差異不顯著)；抗性品系和敏感品系間乙酰膽堿酯酶酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax也無(wú)顯著差異。利用鱗翅目昆蟲ace1基因某些結(jié)構(gòu)域的保守性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,擴(kuò)增到棉鈴蟲acel基因全長(zhǎng)cDNA。棉鈴蟲acel基因含有2085bp開放閱讀框,編碼695氨基酸殘基。同時(shí)在前人研究的基礎(chǔ)上擴(kuò)增了棉鈴蟲的ace2基因。從棉鈴蟲ace1和ace2基因的全長(zhǎng)推導(dǎo)其氨基酸序列,兩個(gè)ace基因在抗性和敏感品系間均有