2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種革蘭氏陰性的嗜鹽細(xì)菌,是世界范圍內(nèi)引起弧菌病的重要病原菌,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在前期研究中,利用抑制性消減雜交技術(shù)建立了鰻弧菌毒力相關(guān)基因文庫,并獲得了一個255 bp的基因片段。為了探索此基因的生物學(xué)功能,在本研究中,應(yīng)用LAPCR技術(shù)獲得了此基因的序列全長。經(jīng)過序列分析和同源比對,確定該基因可能編碼一種膜綁定的具有溶解細(xì)胞壁功能的糖基轉(zhuǎn)移酶MltD。生物信息學(xué)分析表明

2、,鰻弧菌的MltD蛋白由523個氨基酸組成,其功能區(qū)包括N端的信號肽區(qū)域、一個糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域SLT和C端的3個溶解酶結(jié)構(gòu)域LysM,與大腸桿菌(Escherichiacoli)的MltD蛋白結(jié)構(gòu)比較相似,但是大腸桿菌的MltD蛋白由452個氨基酸組成,并且在C端只有2個溶菌酶結(jié)構(gòu)域。據(jù)推測,鰻弧菌MltD蛋白的物理性質(zhì)相對穩(wěn)定,為親水性蛋白;其N端具有一段脂蛋白信號肽,信號肽外的其他部分為非細(xì)胞質(zhì)蛋白;整個分子具有較強的抗原性,二級結(jié)

3、構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主,與其它弧菌中預(yù)測的MltD蛋白有較高的序列相似性。推斷該蛋白為一種外周膜脂蛋白,在弧菌內(nèi)相對保守,抗原性強,可以作為抗弧菌病疫苗開發(fā)。
   應(yīng)用表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)和表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)建立了mltD基因過量表達(dá)體系--大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD。表達(dá)的MltD融合蛋白經(jīng)尿素變性,通過鎳-瓊脂糖親和柱純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測證實,純化的融

4、合蛋白為單一條帶,分子量約為70.2 kDa,與理論值相符。分別測定了純化的MltD融合蛋白和經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液的溶血活性、磷脂酶活性、明膠酶活性和淀粉酶活性,結(jié)果顯示,純化的MltD融合蛋白和經(jīng)過誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液都具有以上的酶活性,而作為對照的透析液和經(jīng)過誘導(dǎo)的攜帶空載體的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-32a

5、(+)的粗酶液都不具上述活性。
   依據(jù)同源重組原理成功構(gòu)建了鰻弧菌CW-1的mltD基因突變株。對野生株和突變株進(jìn)行性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):在胞外酶實驗中,與野生株相比,突變株的明膠酶活性和胞外水解酶活性都顯著降低,并且完全喪失了溶血活性;在抗高滲透壓實驗中,突變株的抗高鹽高滲能力明顯增強;而在偏酸或偏堿的環(huán)境中,突變株的適應(yīng)能力降低;API20E的結(jié)果顯示,突變株失去了野生株原有的對葡萄糖的利用能力;而藥敏實驗中,突變株對菌必治、達(dá)

6、復(fù)欣、先鋒必素、慶大霉素、卡那霉素和羧芐青霉素的敏感性顯著降低,抗性增強。最為重要的是,在毒力研究中發(fā)現(xiàn),突變株對腹腔注射感染的斑馬魚的半數(shù)致死量明顯低于野生株,分別為1.01×102 CFU/尾和3.92×103CFU/尾;而對牙鲆鰓細(xì)胞的侵染速度,突變株也明顯快于野生株,侵染1.5小時觀察結(jié)果表明,突變株侵染細(xì)胞的脫壁比例明顯高于野生株,與對斑馬魚的攻毒實驗結(jié)果相一致,即鰻弧菌mltD基因突變株的毒力較野生株得到了增強。
  

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