嗜卷書虱羧酸酯酶生化毒理學(xué)特性及其mRNA表達(dá)水平研究.pdf

1、羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)是昆蟲體內(nèi)一類水解內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的解毒酶系，在昆蟲對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑抗性中起著極為重要的作用，在對(duì)氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性中亦有一定的作用。本學(xué)位論文以廣泛存在于多種儲(chǔ)藏物中的害蟲嗜卷書虱Liposcelis bostrychophila Badonnel為研究對(duì)象，測(cè)定了其對(duì)9種分別屬于有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性以及3種增效劑(DEF、TPP和D

2、EM)的增效作用，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)該蟲CarE的生化毒理學(xué)特性以及2個(gè)CarE基因在mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 采用藥膜法測(cè)定了9種常用殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱的觸殺毒力。結(jié)果表明，使用的5種有機(jī)磷類殺蟲劑均對(duì)嗜卷書虱具有較高的觸殺毒力，依次為甲基對(duì)氧磷＞毒死蜱＞馬拉硫磷＞乙基對(duì)氧磷＞氧樂果。其中，甲基對(duì)氧磷和乙基對(duì)氧磷的毒力相差在3倍以上。在供試的2種氨基甲酸酯類殺蟲劑中，涕滅威的觸殺毒力顯著高于殘殺威，且

3、高于其余供試殺蟲劑。而2種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的觸殺毒力均顯著低于其它7種供試殺蟲劑，但具有較好的擊倒作用。綜合分析9種常用殺蟲劑單劑對(duì)嗜卷書虱的觸殺毒力發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷類殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱有較好的防治效果。因此在進(jìn)行書虱防治時(shí)，有機(jī)磷類殺蟲劑是比較理想的儲(chǔ)糧保護(hù)劑。
　　 增效作用測(cè)定結(jié)果表明，DEF對(duì)毒死蜱、馬拉硫磷以及涕滅威具有較強(qiáng)的增效作用(增效倍數(shù)分別為7.50、5.90及3.86)，其次，DEF對(duì)氧樂果、甲基對(duì)氧磷、乙基對(duì)氧

4、磷及甲氰菊酯具有一定的增效作用(增效倍數(shù)分別為2.19、2.15、1.64及1.43)，而DEF對(duì)殘殺威和溴氰菊酯均無顯著增效作用。這暗示酯酶參與了除殘殺威、溴氰菊酯外其它7種殺蟲劑在嗜卷書虱體內(nèi)的代謝，而且對(duì)毒死蜱、馬拉硫磷以及涕滅威的代謝起著重要作用。此外，TPP除了對(duì)甲基對(duì)氧磷無顯著增效作用外，對(duì)其余8種供試殺蟲劑均有不同程度的增效作用，其中對(duì)涕滅威具有最強(qiáng)增效作用，增效倍數(shù)達(dá)6.75。這表明羧酸酯酶極有可能參與了除甲基對(duì)氧磷以外

5、所有殺蟲劑的代謝，并且對(duì)涕滅威的代謝起著主要作用。DEM對(duì)氧樂果、毒死蜱、殘殺威及溴氰菊酯均無顯著的增效作用，其中甚至對(duì)氧樂果具有負(fù)增效作用；而對(duì)其余4種殺蟲劑具有一定的增效作用，但增效倍數(shù)均不高，其中對(duì)乙基對(duì)氧磷的增效作用相對(duì)最強(qiáng)為2.97倍。這說明GSTs參與了乙基對(duì)氧磷的代謝，而對(duì)其它殺蟲劑的代謝貢獻(xiàn)不大。
　　 此外，增效作用測(cè)定結(jié)果說明在實(shí)倉防治中，可以考慮將殺蟲劑與增效劑合理搭配使用，以達(dá)到防治書虱的最佳效果。采用微

6、量滴度酶標(biāo)板法分別測(cè)定了以α-NA、β-NA為底物時(shí)嗜卷書虱CarE的生化毒理學(xué)特性(CarE活性、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)、酶促反應(yīng)的理論最適溫度和最適pH值以及9種常用殺蟲劑的離體抑制作用)。結(jié)果表明，以α-NA為底物時(shí)，嗜卷書虱CarE酶促反應(yīng)的理論最適溫度為24.9 ℃、最適pH值為6.5；以β-NA作為底物時(shí)，其最適溫度為25.2 ℃、最適pH值6.2。從9種殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱CarE的抑制中濃度來看，以α-NA或β-NA作為底物時(shí)，甲基對(duì)

7、氧磷和乙基對(duì)氧磷均能高效抑制其活性。其中，與β-NA作為底物相比，當(dāng)α-NA作為底物時(shí)甲基對(duì)氧磷和乙基對(duì)氧磷的抑制作用則更強(qiáng)。然而，α-NA或β-NA作為底物，溴氰菊酯和甲氰菊酯對(duì)嗜卷書虱CarE均無明顯的抑制作用。當(dāng)α-NA為底物時(shí)，其余5種殺蟲劑也體現(xiàn)出較好的抑制作用，依次為馬拉硫磷＞氧樂果＞殘殺威＞涕滅威＞毒死蜱。
　　 當(dāng)β-NA為底物時(shí)，上述5種殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱CarE的抑制作用依次為馬拉硫磷＞毒死蜱＞氧樂果＞殘殺威＞

8、涕滅威。結(jié)果同樣說明書虱CarE普遍對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑敏感，對(duì)擬除蟲菊酯類不敏感。動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果表明嗜卷書虱羧酸酯酶對(duì)β-NA的親和力高于對(duì)α-NA。此外，研究發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷、氧樂果、甲基對(duì)氧磷、乙基對(duì)氧磷、毒死蜱、涕滅威和殘殺威等7種殺蟲劑均可增強(qiáng)嗜卷書虱CarE對(duì)α-NA、β-NA兩種底物的親和力，并降低其催化底物的能力。根據(jù)生物測(cè)定結(jié)果，分析了嗜卷書虱經(jīng)9種常用殺蟲劑處理30分鐘后，其體內(nèi)CarE活性變化的時(shí)間動(dòng)態(tài)(處理后6、12

9、、24、36及48 h)。結(jié)果表明，分別以α-NA、β-NA兩種底物測(cè)得嗜卷書虱CarE的活性并無差異。隨著馬拉硫磷、氧樂果、甲基對(duì)氧磷、涕滅威處理嗜卷書虱后，CarE的活性隨著時(shí)間的增長表現(xiàn)為先降低后升高，隨后逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平。在乙基對(duì)氧磷、毒死蜱、殘殺威和甲氰菊酯處理后的不同時(shí)間，嗜卷書虱CarE的活性均受到抑制，其中，毒死蜱的抑制程度最高。在9種供試殺蟲劑中，溴氰菊酯對(duì)嗜卷書虱CarE的活性沒有顯著的影響。
　　 此外，

10、在活體條件下測(cè)定了9種常用殺蟲劑對(duì)書虱羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，結(jié)果表明9種殺蟲劑在活體條件下的影響不如離體條件下強(qiáng)烈。以α-NA為底物時(shí)，測(cè)得經(jīng)馬拉硫磷和毒死蜱處理后，嗜卷書虱CarE的Km和Vmax變化較大；而以β-NA為底物時(shí)，除乙基對(duì)氧磷和溴氰菊酯外，其它殺蟲劑對(duì)該酶的Km和Vmax均有顯著的影響。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)研究了7種常用殺蟲劑對(duì)嗜卷書虱酯酶同工酶譜的影響，電泳圖譜分析結(jié)果表明，對(duì)照組嗜卷書虱酯酶同工酶共有8條譜

11、帶，且相對(duì)分子量大的酯酶譜帶占據(jù)了很大比例。與對(duì)照相比，殺蟲劑處理后嗜卷書虱酯酶同工酶的電泳條帶顏色均變淺，說明其活性受到抑制而降低，且不同的殺蟲劑對(duì)不同分子量的同工酶的抑制效果不同，表明這些不同分子量的酯酶在代謝不同的殺蟲劑時(shí)作用不同。其中，甲基對(duì)氧磷和乙基對(duì)氧磷處理后，嗜卷書虱酯酶同工酶譜帶幾乎全部消失，表明嗜卷書虱的酯酶同工酶幾乎都屬于B-酯酶。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了在前期研究中克隆獲得的兩個(gè)嗜卷書虱CarE基因(Lb

12、est1和Lb est2 GenBank登錄號(hào)：EU854151和EU854152)經(jīng)3種殺蟲劑(溴氰菊酯、甲基對(duì)氧磷和涕滅威)誘導(dǎo)后其mRNA表達(dá)的時(shí)間動(dòng)態(tài)(8、12、24、36及48 h)。結(jié)果表明Lb est1在甲基對(duì)氧磷、涕滅威以及溴氰菊酯處理后其mRNA的表達(dá)量均隨時(shí)間出現(xiàn)先抑制再上升再恢復(fù)至對(duì)照水平，其中殺蟲劑處理24 h后其表達(dá)量達(dá)最高峰，分別為對(duì)照的1.418倍、1.315倍及1.49倍。而在溴氰菊酯處理后，Lb est