單一田塊核盤菌多樣性分析及攜帶真菌病毒的菌株遺傳特性研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種世界性分布的重要病原菌,能夠侵染75科450多種植物,常見的重要寄主包括油菜、大豆、向日葵等油料作物和多種蔬菜作物。以油菜為例,由核盤菌引起的菌核病是油菜上的首要病害,一般發(fā)病率為10-30％,嚴(yán)重達(dá)80％以上,嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量以及品質(zhì)。高效、安全的防控措施研究一直是菌核病研究重點。利用致病力衰退相關(guān)病毒控制真菌病害是一種重要的生物防治途徑。包括

2、核盤菌在內(nèi),目前已在很多真菌中發(fā)現(xiàn)有致病力衰退相關(guān)的真菌病毒,但是所發(fā)現(xiàn)的種類極其有限。本論文研究旨在從核盤菌中尋找和鑒定更多的真菌病毒,并研究這些病毒對寄主的影響。
　　 從湖北省孝感市郊區(qū)同一油菜田(面積約666 m2)的不同發(fā)病植株的莖稈病斑上成功分離獲得了83株核盤菌菌株,通過對菌絲生長速度、菌絲干重、菌核大小及數(shù)量、菌落形態(tài)、和致病力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)它們在菌落形態(tài)、生長速率和致病力等方面存在顯著的多樣性。經(jīng)過

3、對其中的30個菌株進(jìn)行群體菌絲融合群(MCG)的鑒定分析,發(fā)現(xiàn)這30個菌株可劃分為17個菌絲融合群。其中9個菌絲融合群只包含一個菌株,它們只與自身可進(jìn)行營養(yǎng)親和,其余的MCGs包含2至5個菌株。研究還發(fā)現(xiàn),有些菌株盡管來自同一莖稈,它們也會出現(xiàn)菌絲體不融合現(xiàn)象,造成對同一莖稈的復(fù)合侵染。這些結(jié)果表明即使在很小的范圍內(nèi),核盤菌也存在復(fù)雜的多樣性。
　　 在這83株菌株中,發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株與其它菌株在表型上存在顯著的差異。這些差

4、異包括XG36-1菌株生長緩慢、菌落呈扇型擴(kuò)展、氣生菌絲發(fā)達(dá)、產(chǎn)生菌核數(shù)量較少且不規(guī)則排列于菌落中；在致病力方面,XG36-1菌株幾乎不能在離體油菜葉片上形成病斑,致病力極其微弱。XG36-1菌株的表型與實驗室早期報道的病毒性弱毒菌株Ep-1pN的類似,是一株弱毒的衰退菌株。為了明確XG36-1菌株的衰退機(jī)理,對該菌株進(jìn)行了以下的研究:(1)XG36-1菌株的原生質(zhì)體再生子代生物學(xué)特性分析；(2)XG36-1菌株子囊孢子后代的生物學(xué)特性

5、分析；(3)XG36-1菌株衰退特性的傳染性試驗；(4)對XG36-1菌株的細(xì)胞進(jìn)行電子顯微觀測及病毒粒體的分離；(5)病毒性核酸分離和鑒定分析。發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株的原生質(zhì)體再生后代按表型可以分為三種類型,即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等,其中約有25.5％的再生植株屬于Ⅰ型,約23.8％的再生植株屬于Ⅱ型,Ⅲ型再生植株與弱毒菌株XG36-1并沒有顯著差異,分離頻率為51.7％。共獲得了104個子囊孢子單孢分離物,它們均具有正常菌株的表型,而與X

6、G36-1菌株有顯著的差異。表明XG36-1菌株具有正常菌株的細(xì)胞核遺傳物質(zhì),其衰退系由非染色體遺傳物質(zhì)所致,而且在細(xì)胞中分布不均勻。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)化了核盤菌正常菌株XG36-1A34,篩選并獲得具正常表型且抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子XG36-1A34R。將XG36-1菌株與XG36-1A34R進(jìn)行對峙培養(yǎng),可以自含有潮霉素的PDA平皿中分離到具有XG36-1菌株表型的分離物,表明XG36-1菌株中與衰退相關(guān)的遺傳因子是可以移動的,具有傳染

7、特性。透射電鏡顯微觀測發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株中的菌絲細(xì)胞中存在直徑約為40 nm的類似病毒粒體(VLP),XG36-1菌株的子囊孢子單孢分離物的菌絲細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)VLP,一旦與XG36-1菌株接觸后,將獲得出現(xiàn)類似的VLP。采用蔗糖梯度離心的方法可以自XG36-1菌株的菌絲體中分離到少量的VLP。采用纖維素CF-11吸附法自菌絲體中和自純化的病毒粒體中都沒有成功地分離到病毒的核酸。
　　 而在這83株菌株中也發(fā)現(xiàn)一株XG19-2菌

8、株,它在生長、菌落形態(tài)、菌核形成和致病等方面與核盤菌正常菌株沒有顯著差異。但是,采用CF-11吸附法自其菌絲中提取和分離到大小約為4kb左右的dsRNA片段。利用隨機(jī)引物對該dsRNA片段進(jìn)行了cDNA克降。獲得了2個陽性克隆,將近700多bp,通過測序和序列分析,發(fā)現(xiàn)這兩個陽性克隆均含有一個不完整的閱讀框。將其推定的編碼的肽鏈進(jìn)行Blastp分析,發(fā)現(xiàn)這兩個肽鏈均與真菌病毒Diaporthe ambiguaRNA virus1(DaR

9、V1)的依賴RNA的RNA聚合酶(gdgp)具有較高的同源性。表明XG19-2菌株中的dsRNA實質(zhì)上是一種未知真菌病毒的基因組,命名這種病毒為核盤菌XG19-2 RNA病毒(Sclerotinia sclerotiorum XG19-2 RNA virus,SsXG19-2RV)。
　　 本研究證實即使在面積相對較小的油菜田間核盤菌也具有豐富的多樣性；分離獲得了弱毒菌株XG36-1,并證實其衰退與感染未知的真菌病毒緊密相關(guān),而

10、且存在于菌株XG36-1病毒粒體較少,但是可以使其致病力嚴(yán)重衰退,所以在評估其作為生防因子的價值中有著非常重要的意義。在正常表型的菌株XG19-2中分離和鑒定出一種與DARV1具有顯著親緣關(guān)系的新病毒。而Diaportheambigua RNA virus1是可以使洋梨干枯病病原菌毒力衰退,但是XG19-2中SsXG19-2RV病毒并沒有對寄主產(chǎn)生影響,這不僅表明雖然同種真菌病毒可以在多種寄主中存在,而且在和不同的寄主互作方式也不同,所