腺胃型IBV的分離鑒定及三種不同致病型IBV毒株組織嗜性的比較.pdf

1、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）被公認(rèn)為是冠狀病毒的代表性病毒之一，主要引起雞的一種稱為傳染性支氣管炎的急性高度接觸性傳染病。IBV血清型眾多，且不斷變異，不同型的病毒株間不能或不能完全交叉保護(hù)，免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生；與此同時(shí)，IBV組織親嗜性也在不斷發(fā)生變異，由嗜呼吸器官、泌尿器官向消化道、生殖器官甚至肌肉組織轉(zhuǎn)移，目前已有呼吸型、腎型、腸型、腺胃型以及多型混合的IBV毒株，致病

2、性越來(lái)越復(fù)雜，尤其是腺胃型IBV在最近幾年引起了國(guó)際上一些學(xué)者的關(guān)注。由此可見(jiàn)，開(kāi)展有關(guān)IBV組織親嗜性變異研究，探索其變異機(jī)制，不僅可為雞傳染性支氣管炎的有效防治提供重要的理論依據(jù)，還可以為相關(guān)冠狀病毒的多組織嗜性研究提供參考和借鑒。
　　 本研究以腺胃型IBV為核心研究對(duì)象，針對(duì)其與呼吸型、腎型等不同致病性IBV的S1基因、與細(xì)胞表面蛋白雞氨肽酶N（chAPN）體外結(jié)合能力和在感染SPF雞機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律等方面的差異進(jìn)行

3、了比較分析，同時(shí)檢測(cè)了chAPN在不同日齡SPF雞機(jī)體內(nèi)各組織中表達(dá)變化，旨在通過(guò)對(duì)上述致病型IBV特性研究分析來(lái)探討IBV多組織嗜性的形成的可能機(jī)制。
　　 1、腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒的初步分離鑒定
　　 成功從黑龍江省某雞場(chǎng)發(fā)生的以腺胃腫大為特征的病死雞中分離到1株具有冠狀病毒特性的A2-2病毒分離株。通過(guò)雞胚傳代、血凝性測(cè)定、電鏡觀察、RT-PCR檢測(cè)和動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，初步確定所分離病毒為一株腺胃型雞傳染性支氣管

4、炎病毒。
　　 2、IBV A2-2分離株S1基因的序列分析
　　 從IBV結(jié)構(gòu)基因S1基因的角度研究病毒的組織嗜性。對(duì)IBV A2-2分離株與相關(guān)參考毒株的S1基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析表明：A2-2與QXIBV、D971、GE三株典型的腺胃型IBV親緣關(guān)系較近，同時(shí)它們也和近年來(lái)分離到的LX4、CK-CH-LSD-07V等基因型毒株親緣關(guān)系較近，分為第一組，表現(xiàn)為與時(shí)間及地域流行性的關(guān)聯(lián)更大；而ZJ971、1-98和3-

5、97等腺胃型毒株與H120、H52、W93疫苗株親緣關(guān)系很近，分為第二組，提示疫苗株IBV的變異可能是腺胃型IBV的一個(gè)重要來(lái)源；Q1、J2等腺胃型毒株則與大多數(shù)毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分為第三組。這提示腺胃型IBV可能有著不同的來(lái)源，同一基因型的IBV也可以表現(xiàn)出不同的致病型。
　　 3、源自不同致病型的三株IBV與chAPN體外結(jié)合能力的差異比較
　　 經(jīng)原核表達(dá)獲得融合蛋白His-chAPN，用ELISA方法比較源自不同

6、致病型的三株IBV與雞氨肽酶N體外結(jié)合能力的差異，以期從病毒結(jié)合細(xì)胞表面蛋白的角度研究IBV的組織嗜性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三株不同的致病型IBV與chAPN的結(jié)合力表現(xiàn)為A2-2>S-03>M41，這說(shuō)明不同致病型的IBV毒株與chAPN的結(jié)合力的確存在差異，且該差異可能與IBV的組織嗜性變化有關(guān)。
　　 4、源自不同致病型的三株IBV及chAPN在感染SPF雞體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布
　　 應(yīng)用熒光定量PCR方法和間接免疫熒光技術(shù)分

7、別從核酸及蛋白質(zhì)水平對(duì)IBV呼吸型毒株M41、腎型分離株S-03和腺胃型分離株A2-2在感染SPF雞體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)，研究結(jié)果表明：三株IBV在感染機(jī)體后最先定殖的部位均為氣管，其中呼吸型毒株M41對(duì)氣管的依賴性顯得相對(duì)較高。三株IBV在肺臟中的增殖程度差異大于氣管，A2-2和S-03分離株對(duì)于肺的親嗜性低于M41株。S-03株在腎臟的增殖能力最強(qiáng)，豐度和持續(xù)時(shí)間很高；A2-2株在腎臟的增殖能力高于M41，這不僅與剖檢后所觀察到的腎

8、臟病變程度相吻合，也與以往的研究結(jié)果相符：腺胃型IB常常伴隨一定程度的腎臟損傷。A2-2分離株是嗜腺胃的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)毒株，S-03感染組雞只的腺胃中幾乎檢測(cè)不到病毒RNA，M41組也僅有少量病毒，可以看出A2-2在腺胃上增殖能力的優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)高于M41株在呼吸道和S-03在腎臟的增殖能力。此外，三株IBV在肝臟、回腸、法氏囊以及血液中增殖情況差異不大，病毒對(duì)肝臟和法氏囊大多呈一過(guò)性感染，血液和回腸中的病毒量則更低一些。與人工感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比可以

9、發(fā)現(xiàn)感染雞的臨床表現(xiàn)與病毒滴度變化存在時(shí)間相關(guān)性。
　　 本研究中同樣使用Real time PCR方法和間接免疫熒光技術(shù)來(lái)檢測(cè)病毒感染雞體后不同組織中chAPN的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明chAPN分布廣泛，這與IBV多樣的組織嗜性相對(duì)應(yīng)，而其靶器官又表現(xiàn)為比較高和穩(wěn)定的蛋白表達(dá)量。攻毒后不同組織中chAPN的含量變化呈現(xiàn)出比較相似的規(guī)律：氣管當(dāng)中chAPN含量較高，且隨著日齡的增加而遞減；腺胃當(dāng)中chAPN含量稍低

10、，變化趨勢(shì)與氣管一樣；腎臟中chAPN含量雖然不高，但一直保持穩(wěn)定。這都提示chAPN作為IBV的特異性受體跟病毒的組織嗜性有很大的關(guān)聯(lián)。
　　 從以上兩部分的分析結(jié)果可以看出，IBV和chAPN在雞體內(nèi)的分布存在相關(guān)性：氣管、腎臟、腺胃中chAPN的含量相對(duì)較高且穩(wěn)定，IBV也相應(yīng)地對(duì)這三個(gè)組織有很強(qiáng)的親嗜性。但chAPN的分布比IBV的組織嗜性范圍更廣，比如腸道中的chAPN含量穩(wěn)定，且高于腎臟，但I(xiàn)BV對(duì)其嗜性卻較弱。針對(duì)