禽傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)技術(shù)及其嗜腎型毒株雞胚傳代毒的致病性分析.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)是引起禽類傳染性支氣管炎的病原體，長(zhǎng)期以來(lái)一直持續(xù)的給禽類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的威脅。疫苗的使用是預(yù)防該病的重要手段，快速準(zhǔn)確的病原和抗體檢測(cè)診斷方法是臨床診斷與預(yù)防效果檢測(cè)的重要手段。為此，本論文開(kāi)展了此項(xiàng)研究工作。
　　針對(duì)主要流行的呼吸型、腎型以及肌肉型4/91毒株，基于S1基因和nsp12基因片段設(shè)計(jì)出三對(duì)特異性引物，建立了IBV的RT-PCR分

2、型檢測(cè)方法。使用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，腎型IBV可以得到213bp和686bp的兩條帶，4/91型毒株可以得到213bp和261 bp的兩條帶，而呼吸型毒株只能得到213bp的一條帶，其它常見(jiàn)禽類病毒未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析驗(yàn)證為IBV特定的序列。使用該方法對(duì)呼吸型和腎型IBV毒株的cDNA最低檢出量為0.225 ng，肌肉型4/91型最低檢出量為2.25 ng。分型PCR方法對(duì)60份臨床組織樣品檢測(cè)結(jié)果與雞胚病毒分離結(jié)果完

3、全一致，表明本研究建立的RT-PCR分型檢測(cè)方法與病毒分離方法具有很好的吻合度。
　　以IBV H120為毒種，摸索了傳染性支氣管炎病毒血凝抗原的制備方法，結(jié)果顯示，血凝抗原的制備條件為超濾結(jié)合差速離心將IBV的抗原濃度濃縮至109.0EID50/0.1 mL，濃縮的IBV毒液用終濃度為2.5-3 U/mL的PLC1或50％的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清在37℃水浴3-4小時(shí)即可制備IBV血凝抗原。研究了血凝抑制試驗(yàn)的待檢樣品處理方法

4、，證明，待檢血清在進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)之前必須用25％的酸化高嶺土處理90分鐘。分析了血凝抑制試驗(yàn)的反應(yīng)條件，證明，血凝抑制試驗(yàn)的反應(yīng)溫度為4℃，反應(yīng)時(shí)間為45-60分鐘。滅活方法為0.1％的β-丙內(nèi)酯于4℃處理抗原24h。人工免疫后的抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示該檢測(cè)方法相比于ELISA方法可以識(shí)別更早期的抗體。
　　IBV腎型毒株SC021202經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳代獲得的F60代病毒液，以0.1mL、0.2 mL兩個(gè)劑量，借助滴鼻方式感染

5、1、7、21、60日齡的SPF雞，測(cè)定了IBV SC021202毒株雞胚適應(yīng)60代毒的致病性。結(jié)果顯示:1日齡0.1mL組的死亡率為70％，0.2 mL組的死亡率為90％;7日齡的死亡率均為40％，而21、60日齡的雞感染后無(wú)明顯臨床癥狀。剖檢病死雞可見(jiàn)腎臟出現(xiàn)明顯的腫脹，內(nèi)有白色尿酸鹽沉積，呈現(xiàn)典型的“花斑腎”樣病變。排毒動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果顯示，排毒時(shí)間為感染后4-10天。組織病料的病毒核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，腎臟的檢出率高于氣管和肺臟。1、7日