Bt毒素寡聚體形成與脂筏的關(guān)系以及鈣粘蛋白的免疫檢測(cè)技術(shù)探索.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性昆蟲(chóng)病原細(xì)菌，芽孢形成期其能產(chǎn)生具有特異毒性的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。Cry1Ac毒素是蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的一種殺蟲(chóng)晶體蛋白，它能夠在中腸上皮細(xì)胞形成孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂而死亡。脂筏是刷狀緣膜囊泡脂雙層內(nèi)一個(gè)特殊的微區(qū)結(jié)構(gòu)，此區(qū)域富含膽固醇、鞘脂類(lèi)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固蛋白，

2、是細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的平臺(tái)，在很多生物學(xué)活動(dòng)中都起到十分重要的作用。CrylAc活化毒素單體和昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(BBMV)在37℃條件下孵育1h能夠形成250kDa的Cry1Ac毒素寡聚體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)是昆蟲(chóng)膜穿孔的致死關(guān)鍵。而毒素寡聚體的形成是由于Cry1Ac毒素單體與BBMV上鈣粘素受體的交互作用而形成的，之后形成的寡聚體再在氨肽酶受體的作用下與GPI-錨固蛋白結(jié)合，最終在GPI-錨固蛋白的作用下在細(xì)胞膜上形成穿孔導(dǎo)致細(xì)胞腫脹

3、最終死亡。
　　 脂筏是BBMV上的特殊微區(qū)，離體BBMV與離體脂筏是否都能通過(guò)與Cry1Ac毒素單體孵育而形成寡聚體結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這一點(diǎn)重點(diǎn)進(jìn)行了研究。Bt毒素對(duì)敏感和抗性棉鈴蟲(chóng)品系的作用方式是否相同，抗性品系是否能形成寡聚體，不同鱗翅目昆蟲(chóng)形成寡聚體機(jī)制是否相同，這些是我們所要研究的主要問(wèn)題。我們通過(guò)對(duì)棉鈴蟲(chóng)敏感品系和抗性品系，菜青蟲(chóng)，二化螟，斜紋夜蛾這五種鱗翅目昆蟲(chóng)的研究來(lái)探討這一問(wèn)題，我們采用Western-blott

4、ing試驗(yàn)方法證明：Cry1Ac毒素寡聚體的形成與離體脂筏結(jié)構(gòu)沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)，離體條件下Cry1Ac毒素只能與BBMV孵育才能形成寡聚體結(jié)構(gòu)，但脂筏結(jié)構(gòu)必須保持其完整性。本試驗(yàn)通過(guò)使用膽固醇抑制劑甲基-β-環(huán)糊精和皂苷處理BBMV，離心從而去掉脂筏中的膽固醇，之后BBMV與Cry1Ac毒素孵育則寡聚體不能形成，說(shuō)明脂筏完整性被破壞后不能行使其生物學(xué)功能；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)脂筏微區(qū)上GPI-錨固蛋白也是寡聚體形成的一個(gè)關(guān)鍵因素，PIPLC能夠

5、去除GPI錨固結(jié)構(gòu)，用PIPLC處理BBMV使其去掉GPI-錨固蛋白后，寡聚體也不能形成。
　　 試驗(yàn)中我們還分別采用Dot-blotting, ELISA的方法檢測(cè)棉鈴蟲(chóng)抗性和敏感品系，二化螟，斜紋夜蛾中的鈣粘蛋白。應(yīng)用Dot-blotting和ELISA方法檢測(cè)分別從定性和定量的角度對(duì)鈣粘蛋白在昆蟲(chóng)中腸的存在情況進(jìn)行分析，目的是探測(cè)一種田間抗性檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法。在Dot-blotting檢測(cè)中，田間采集各單頭棉鈴蟲(chóng)之間并無(wú)明顯