植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析及水稻OPR家族基因分子生物學功能研究.pdf

1、茉莉酸是植物體內廣泛存在的一種植物激素，由亞麻酸經十八烷碳烯酸代謝途徑合成的；它不僅作為內源生長物質，在植物的整個發(fā)育進程中起調節(jié)作用，而且還作為局部和系統(tǒng)的信號分子參與生物和非生物逆境脅迫的應答。12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR)是茉莉酸生物合成即十八烷碳烯酸代謝途徑中的一個關鍵酶，控制茉莉酸合成的最后步驟。在植物基因組中，OPR屬于OYE家族，是黃素單核苷酸依賴

2、的氧化還原酶，并且以多基因家族形式存在。目前，盡管對擬南芥及其他物種的少數幾個OPR基因在生化和遺傳方面進行研究并取得了一些重要結果，但是對于整個植物OPR基因家族的進化及生物學功能(生化和生理功能)并不很清楚?；诖耍狙芯吭谒镜?染色體S5區(qū)基因注釋和研究基礎上，采取比較基因組學與現代分子生物學實驗技術相結合的研究策略，首先從整體層面上對植物OPR基因家族進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以探究植物OPR基因家族的起源、進化及潛在的功能分化；其次

3、在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析基礎上，從局部層面上對水稻OPR家族基因進行分子生物學研究，以探究水稻OPR家族基因的蛋白結構、生化特性及可能的生理功能。
　　 1)在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育方面：本研究采用綜合生物信息學和系統(tǒng)發(fā)育的研究方法進行比較基因組學研究，以探究植物OPR基因家族的系統(tǒng)發(fā)育、結構進化及可能的功能分化，取得了以下結果：
　　 ①利用公共數據庫資源，在植物基因組中鑒定了105個OPR基因；其中，在6

4、個不同譜系的11個代表性物種(藻類：萊茵衣藻和團藻；苔蘚：小立碗蘚；蕨類：卷柏；裸子植物：云杉；單子葉植物：水稻、玉米和高粱；雙子葉植物：擬南芥、楊樹和苜蓿)中鑒定了74個OPR基因，均以多基因家族形式存在。
　　 ②通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，在植物基因組中，存在7個保守的OPR亞家族：其中，在水生植物中，僅存在一個OPR亞家族即sub.Ⅶ；而在陸生植物中，則存在六個OPR亞家族即subs.Ⅰ～Ⅵ。進一步分析提示，在水生和陸生植物分

5、化后，譜系特異擴增尤其是串聯重復是陸生植物OPR基因家族擴增與進化的主要機制，并導致多個OPR亞家族的產生。
　　 ③通過exon-intron結構分析表明，不同譜系物種中的OPR基因內含子的數目和長度呈現多樣性，而內含子的位置和相位卻十分保守；這一研究結果并結合系統(tǒng)發(fā)育分析提示，在OPR家族基因結構進化過程中，不同譜系間及同一譜內的OPR基因發(fā)生持續(xù)內含子丟失，從而導致OPR基因結構的多樣性?；谏鲜鲅芯拷Y果，提出了一個關于O

6、PR家族基因結構演化的模型。
　　 ④通過功能分化分析揭示，在進化過程中，由于受到局部正選擇作用，不同OPR亞家族及其成員間發(fā)生了功能分化，并且導致功能分化的關鍵氨基酸位點主要分布于OPR蛋白三維結構的外側，即α螺旋和底物結合區(qū)。
　　 2)在OsOPR家族基因分子生物學功能方面：本研究在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析基礎上，選擇分別代表五個不同OPR亞家族的OsOPR基因即OsOPR04-1(sub.Ⅰ)、OsOPR0

7、8-1(sub.Ⅱ)、OsOPR06-1(sub.Ⅲ)、OsOPR01-1(sub.Ⅳ)和OsOPR02-1(sub.Ⅴ)，采取同源建模、原核表達、半定量RT-PCR及轉基因方法研究水稻不同OPR亞家族基因的蛋白結構、生化及生理功能，取得了以下結果：
　　 ①通過同源建模及蛋白結構比較分析顯示，盡管不同亞家族OPR蛋白的三維結構的基本骨架高度保守即由8個α/β交替排列形成桶狀結構，但仍存兩個在蛋白三維構象上呈現明顯差異的MVR

8、i和ii區(qū)；位于MVR i底物結合區(qū)決定底物與蛋白的特異結合，而MVR ii則影響底物進入由MVR i形成的“口袋”。
　　 ②通過蛋白體外表達及酶活分析表明，不同亞家族OPR蛋白酶活存在顯著差異且呈現明顯的底物偏好性；除OsOPR02-1外，其他四個OPR蛋白對反式-2-己烯醛、12-氧-植物二烯酸和順丁烯二酸均呈現出強或中等程度的催化活性，提示這些亞家族OPR基因可能參與十八烷碳烯酸代謝的兩個主要分支HPL和AOS途徑，以及

9、能量代謝TCA途徑來調節(jié)植物的生長發(fā)育及防御應答。
　　 ③通過基因表達譜分析顯示，OsOPR家族基因的表達呈現明顯的組織特異性且不同程度的響應多種非生物逆境脅迫誘導。OsOPR04-1(sub.Ⅰ)和OsOPR08-1(sub.Ⅱ)在各種組織及誘導條件下均呈現較強的表達，提示共存于單、雙子葉植物中的subs.Ⅰ和Ⅱ基因可能在植物生長、發(fā)育及防御中起重要作用；而OsOPR06-1(sub.Ⅲ)、OsOPR01-1(sub.Ⅳ)和