龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝和信號轉導相關基因的克隆與表達.pdf

1、本研究以龍眼（Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi）胚性愈傷組織為材料，克隆生長素信號轉導相關基因（生長素受體基因、生長素結合蛋白基因和生長素應答因子基因）、乙烯生物合成關鍵基因（ACC合酶基因和ACC氧化酶基因）、乙烯信號轉導相關基因（乙烯受體基因），并采用q-PCR分析其表達水平在龍眼體胚發(fā)生過程中的動態(tài)變化規(guī)律，以期為進一步了解激素在龍眼體胚發(fā)生中的調控機制奠定基礎。主要研究結果如下：
　　

2、 1.龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉導相關基因的克隆
　　 采用RT-PCR結合RACE方法，克隆得到龍眼胚性愈傷組織生長素信號轉導相關基因3個：①龍眼胚性愈傷組織生長素受體基N（DL-TIR1，GenBank GQ870264），2328 bp的cDNA全長序列包含一個長為1761 bp的ORF，并包含5’-UTR為118 bp，3’-UTR為449 bp，3’poly（A）尾長16 bp；②龍眼胚性愈傷組織生長素結合蛋白

3、基因（DL-ABP1，GenBank GQ900592），869 bp的cDNA全長序列包含一個長為567 bp的ORF，并包含5’-UTR為43 bp，3’-UTR為259 bp，3'poly（A）尾長19 bp；③龍眼胚性愈傷組織生長素應答因子基因（DL-ARF，GenBankGQ923778）：2695 bp的cDNA全長序列包含一個長為2046 bp的ORF，并包含5'-UTR為163 bp，3'-UTR為486 bp，3’po

4、ly（A）尾長17 bp。同時，還克隆了乙烯合成相關基因和乙烯受體基因各2個：①龍眼胚性愈傷組織ACC（乙烯合成前體）合酶基因（DL-ACS，GenBankFJ617537），1817 bp的cDNA全長序列包含一個長為1437 bp的ORF，并包含5’-UTR為73 bp，3'-UTR為307 bp，3’poly（A）尾長16 bp；②龍眼胚性愈傷組織ACC（乙烯合成前體）氧化酶基因（DL-ACO，GenBank FJ534854），

5、1315 bp的cDNA全長序列包含一個長為948bp的ORF，并包含5’-UTR為86 bp，3'-UTR為281 bp，3’poly（A）尾長13 bp，DNA擴增序列長為1660 bp（GenBank GU123929），包含3個內含子，內含子的剪切位點均符合“GT-AG”規(guī)則；③龍眼胚性愈傷組織乙烯受體基因（DL-ETR1，GenBankFJ513322），2611 bp的cDNA全長序列包含一個長為2223 bp的ORF，并包

6、含3’-UTR為388 bp，3'poly（A）尾長24 bp；④龍眼胚性愈傷組織乙烯受體基因（DL-ERS1，GenBank FJ513323），2259 bp的cDNA全長序列包含一個長為1911 bp的開放閱讀框，并包含3’-UTR為348 bp，3’poly（A）尾長17 bp，DNA擴增序列長為2236 bp（GenBank GU123930），包含2個內含子，內含子的剪切位點符合“GT-AG”規(guī)則。
　　 2.龍眼體

7、胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉導相關基因的生物信
　　 龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉導相關基因的生物信息學分析結果表明：生長素信號轉導基因：①DL-TIR1基因，編碼586個氨基酸，屬親水蛋白，含有3個跨膜結構，36個功能位點，1個F-box結構域，α螺旋是其主要的二級結構，亞細胞定位在細胞質中，與不同植物來源的TIR1的同源性為57％-85％，DL-TIR1可能通過N端的F-box結構域參與龍眼體胚生長素調控的SCFDL-

8、TIR1-Aux/IAAs結合，將Aux/IAAs通過泛素化途徑降解，開啟生長素信號途徑；②DL-ABP1基因，編碼188個氨基酸，屬親水蛋白，含有1個跨膜結構，7個功能位點，屬于Auxin-binding protein家族，無規(guī)則卷曲是其主要的二級結構，在N端前22個氨基酸是信號肽，亞細胞定位在內質網(wǎng)中，與不同植物來源的ABP1的同源性較高為72％-87％，推測DL-ABP1通過另一條與DL-TIR1所介導的基因調控相平行的細胞學信

9、號傳遞途徑參與龍眼體胚所涉及的生長素誘導的快速反應；③DL-ARF編碼681個氨基酸，屬親水蛋白，含有2個跨膜結構，36個功能位點，2個保守結構域，屬于Transcriptional factor B3家族，無規(guī)則卷曲結構是其主要的二級結構，亞細胞定位在細胞核中，與不同植物來源的ARF的同源性為41％-81％，DL-ARF可能屬于轉錄抑制因子，在龍眼體胚中功能需要進一步探索。
　　 乙烯合成相關基因：①DL-ACS基因，編碼47

10、8個氨基酸，屬親水蛋白，含有2個跨膜結構，21個功能位點，3個保守結構域及1個化學反應結合位點，屬于ACC Synthase家族，無規(guī)則卷曲是其主要的二級結構，有1個卷曲螺旋，亞細胞定位在細胞核中，與不同植物來源的ACS的同源性為63％-77％，DL-ACS可能響應龍眼體胚基礎乙烯的合成；②DL-ACO編碼315個氨基酸，屬親水蛋白，有8個功能位點，含有1個Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase結構域

11、，無規(guī)則卷曲是其主要的二級結構，有1個卷曲螺旋，亞細胞定位在細胞質中，與不同植物來源的ACO的同源性為47％-86％，DL-ACO可能響應龍眼體胚基礎乙烯的生成。
　　 乙烯信號轉導基因：①DL-ETR1基因，編碼740個氨基酸，屬疏水蛋白，含有3個跨膜結構，有28個功能位點，8保守個結構域，屬于Signal transduction histidine kinase，hybrid-type，ethylene sensor家族，

12、α螺旋是其主要的二級結構，有1個卷曲螺旋，亞細胞定位在質體中，與不同植物來源的ETR1的同源性為63％-91％，DL-ETR1在龍眼體胚乙烯受體家族中占有突出的功能地位，高度保守的DL-ETR1-Cys65可能與乙烯受體活性和乙烯敏感性相關的；②DL-ERS1基因，編碼636個氨基酸，屬疏水蛋白，含有4個跨膜結構，有25個功能位點，6個保守結構域，α螺旋是其主要的二級結構，有1個區(qū)域卷曲螺旋，亞細胞定位在細胞質中，與不同植物來源的ERS

13、1的同源性為36％-80％，DL-ERS1和DL-ETR1可能在龍眼體胚乙烯信號轉導上具有相似的生物學特性，不過在信號轉導量上有不同。
　　 3龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉導相關基因的定量表達分析
　　 3.1龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉導相關基因的定量表達情況
　　 生長素信號轉導基因：①DL-TIR1在龍眼體胚的8個階段均有表達，整個變化趨勢呈不規(guī)則字母“W”狀，子葉形胚（Stage8）的表達量最

14、高；②DL-ABP1在龍眼體胚的各階段均有表達，整體轉錄水平的變化趨勢呈不規(guī)則的“W”狀，松散型胚性愈傷組織（Stage1）、不完全胚性緊實結構（Stage3）、子葉形胚（Stage8）表達量相對較高，球形胚（Stage5）的表達量最低；③DL-ARF整體轉錄水平的變化趨勢呈不規(guī)則的“M”狀，松散型胚性愈傷組織（Smge1）、球形胚（Stage5）、子葉形胚（Stage8）的表達量相對較低，胚性愈傷組織Ⅱ（Stage2）、不完全胚性緊實

15、結構（Stage3）、心形胚（Stage6）的表達量相對較高。
　　 乙烯合成相關基因：①DL-ACS相對表達量變動態(tài)變化存在較大的時期差異，球形胚（Stage5）的表達量最高，魚雷形胚（Stage7）的表達量最低；②DL-ACO表達量整體的變化趨勢呈字母“M”狀，不完全胚性緊實結構（Stage3）和心形胚（Stage6）分別出現(xiàn)了峰值，松散型的胚性愈傷組織（Stage1）、球形胚（Stage5）以及子葉形胚（Stage8）的表

16、達量相對較低。
　　 乙烯信號轉導基因：①DL-ETR1表達量整體的變化趨勢呈不規(guī)則“W”狀，松散型的胚性愈傷組織（Stage1）的表達量最高，心形胚（Stage6）階段的表達量最低；②龍眼體胚發(fā)生過程的8個階段均有DL-ERS1基因的表達，但除了子葉形胚（Stage8）其它7個階段的表達量都很低，子葉形胚（Stage8）的表達量最高，魚雷形胚（Stage7）的表達量極低，幾乎不表達。
　　 3.2龍眼體胚發(fā)生過程中激素

17、代謝與信號轉導相關基因表達情況相互之間的聯(lián)系
　　 作為“可能”生長素受體之一的DL-4BP1基因整體轉錄水平的變化趨勢與生長素受體DL-TIR1基因相似。乙烯生物合成途徑中DL-ACS處于DL-ACO的上游，但兩者的轉錄水平呈現(xiàn)出幾乎完全相反的動態(tài)變化趨勢。同為乙烯受體家族I的DL-ETR1與DL-ERS1有著不同的表達模式。生長素受體DL-TIR1和乙烯合成相關基因DL-ACS兩者的變化趨勢基本相似。內源IAA的整個變化趨勢

18、和DL-ACD基因的轉錄水平的變化趨勢都呈雙峰型，只是IAA的兩峰值出現(xiàn)的時間比DL-ACO的轉錄水平稍提早了一個階段。與生長素信號轉導相關的DL-ARF基因與乙烯生物合成相關的DL-ACO整體轉錄水平的變化趨勢均呈不規(guī)則的“M”狀，第一個表達峰出現(xiàn)DL-ARF比DL-ACO稍早一個階段，DL-ACO表達量會比DL-ARF稍高。龍眼體胚中，DL-ARF、DL-ACO是否是生長素和乙烯互作的交叉點，值得我們進一步深入探索。