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文檔簡介
1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)胚性愈傷組織為材料,克隆生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(生長素受體基因、生長素結(jié)合蛋白基因和生長素應(yīng)答因子基因)、乙烯生物合成關(guān)鍵基因(ACC合酶基因和ACC氧化酶基因)、乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(乙烯受體基因),并采用q-PCR分析其表達(dá)水平在龍眼體胚發(fā)生過程中的動態(tài)變化規(guī)律,以期為進(jìn)一步了解激素在龍眼體胚發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
2、 1.龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的克隆
采用RT-PCR結(jié)合RACE方法,克隆得到龍眼胚性愈傷組織生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因3個:①龍眼胚性愈傷組織生長素受體基N(DL-TIR1,GenBank GQ870264),2328 bp的cDNA全長序列包含一個長為1761 bp的ORF,并包含5’-UTR為118 bp,3’-UTR為449 bp,3’poly(A)尾長16 bp;②龍眼胚性愈傷組織生長素結(jié)合蛋白
3、基因(DL-ABP1,GenBank GQ900592),869 bp的cDNA全長序列包含一個長為567 bp的ORF,并包含5’-UTR為43 bp,3’-UTR為259 bp,3'poly(A)尾長19 bp;③龍眼胚性愈傷組織生長素應(yīng)答因子基因(DL-ARF,GenBankGQ923778):2695 bp的cDNA全長序列包含一個長為2046 bp的ORF,并包含5'-UTR為163 bp,3'-UTR為486 bp,3’po
4、ly(A)尾長17 bp。同時,還克隆了乙烯合成相關(guān)基因和乙烯受體基因各2個:①龍眼胚性愈傷組織ACC(乙烯合成前體)合酶基因(DL-ACS,GenBankFJ617537),1817 bp的cDNA全長序列包含一個長為1437 bp的ORF,并包含5’-UTR為73 bp,3'-UTR為307 bp,3’poly(A)尾長16 bp;②龍眼胚性愈傷組織ACC(乙烯合成前體)氧化酶基因(DL-ACO,GenBank FJ534854),
5、1315 bp的cDNA全長序列包含一個長為948bp的ORF,并包含5’-UTR為86 bp,3'-UTR為281 bp,3’poly(A)尾長13 bp,DNA擴(kuò)增序列長為1660 bp(GenBank GU123929),包含3個內(nèi)含子,內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合“GT-AG”規(guī)則;③龍眼胚性愈傷組織乙烯受體基因(DL-ETR1,GenBankFJ513322),2611 bp的cDNA全長序列包含一個長為2223 bp的ORF,并包
6、含3’-UTR為388 bp,3'poly(A)尾長24 bp;④龍眼胚性愈傷組織乙烯受體基因(DL-ERS1,GenBank FJ513323),2259 bp的cDNA全長序列包含一個長為1911 bp的開放閱讀框,并包含3’-UTR為348 bp,3’poly(A)尾長17 bp,DNA擴(kuò)增序列長為2236 bp(GenBank GU123930),包含2個內(nèi)含子,內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)符合“GT-AG”規(guī)則。
2.龍眼體
7、胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的生物信
龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因:①DL-TIR1基因,編碼586個氨基酸,屬親水蛋白,含有3個跨膜結(jié)構(gòu),36個功能位點(diǎn),1個F-box結(jié)構(gòu)域,α螺旋是其主要的二級結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中,與不同植物來源的TIR1的同源性為57%-85%,DL-TIR1可能通過N端的F-box結(jié)構(gòu)域參與龍眼體胚生長素調(diào)控的SCFDL-
8、TIR1-Aux/IAAs結(jié)合,將Aux/IAAs通過泛素化途徑降解,開啟生長素信號途徑;②DL-ABP1基因,編碼188個氨基酸,屬親水蛋白,含有1個跨膜結(jié)構(gòu),7個功能位點(diǎn),屬于Auxin-binding protein家族,無規(guī)則卷曲是其主要的二級結(jié)構(gòu),在N端前22個氨基酸是信號肽,亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,與不同植物來源的ABP1的同源性較高為72%-87%,推測DL-ABP1通過另一條與DL-TIR1所介導(dǎo)的基因調(diào)控相平行的細(xì)胞學(xué)信
9、號傳遞途徑參與龍眼體胚所涉及的生長素誘導(dǎo)的快速反應(yīng);③DL-ARF編碼681個氨基酸,屬親水蛋白,含有2個跨膜結(jié)構(gòu),36個功能位點(diǎn),2個保守結(jié)構(gòu)域,屬于Transcriptional factor B3家族,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是其主要的二級結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中,與不同植物來源的ARF的同源性為41%-81%,DL-ARF可能屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子,在龍眼體胚中功能需要進(jìn)一步探索。
乙烯合成相關(guān)基因:①DL-ACS基因,編碼47
10、8個氨基酸,屬親水蛋白,含有2個跨膜結(jié)構(gòu),21個功能位點(diǎn),3個保守結(jié)構(gòu)域及1個化學(xué)反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn),屬于ACC Synthase家族,無規(guī)則卷曲是其主要的二級結(jié)構(gòu),有1個卷曲螺旋,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中,與不同植物來源的ACS的同源性為63%-77%,DL-ACS可能響應(yīng)龍眼體胚基礎(chǔ)乙烯的合成;②DL-ACO編碼315個氨基酸,屬親水蛋白,有8個功能位點(diǎn),含有1個Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase結(jié)構(gòu)域
11、,無規(guī)則卷曲是其主要的二級結(jié)構(gòu),有1個卷曲螺旋,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中,與不同植物來源的ACO的同源性為47%-86%,DL-ACO可能響應(yīng)龍眼體胚基礎(chǔ)乙烯的生成。
乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因:①DL-ETR1基因,編碼740個氨基酸,屬疏水蛋白,含有3個跨膜結(jié)構(gòu),有28個功能位點(diǎn),8保守個結(jié)構(gòu)域,屬于Signal transduction histidine kinase,hybrid-type,ethylene sensor家族,
12、α螺旋是其主要的二級結(jié)構(gòu),有1個卷曲螺旋,亞細(xì)胞定位在質(zhì)體中,與不同植物來源的ETR1的同源性為63%-91%,DL-ETR1在龍眼體胚乙烯受體家族中占有突出的功能地位,高度保守的DL-ETR1-Cys65可能與乙烯受體活性和乙烯敏感性相關(guān)的;②DL-ERS1基因,編碼636個氨基酸,屬疏水蛋白,含有4個跨膜結(jié)構(gòu),有25個功能位點(diǎn),6個保守結(jié)構(gòu)域,α螺旋是其主要的二級結(jié)構(gòu),有1個區(qū)域卷曲螺旋,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中,與不同植物來源的ERS
13、1的同源性為36%-80%,DL-ERS1和DL-ETR1可能在龍眼體胚乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上具有相似的生物學(xué)特性,不過在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)量上有不同。
3龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的定量表達(dá)分析
3.1龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的定量表達(dá)情況
生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因:①DL-TIR1在龍眼體胚的8個階段均有表達(dá),整個變化趨勢呈不規(guī)則字母“W”狀,子葉形胚(Stage8)的表達(dá)量最
14、高;②DL-ABP1在龍眼體胚的各階段均有表達(dá),整體轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢呈不規(guī)則的“W”狀,松散型胚性愈傷組織(Stage1)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(Stage3)、子葉形胚(Stage8)表達(dá)量相對較高,球形胚(Stage5)的表達(dá)量最低;③DL-ARF整體轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢呈不規(guī)則的“M”狀,松散型胚性愈傷組織(Smge1)、球形胚(Stage5)、子葉形胚(Stage8)的表達(dá)量相對較低,胚性愈傷組織Ⅱ(Stage2)、不完全胚性緊實(shí)
15、結(jié)構(gòu)(Stage3)、心形胚(Stage6)的表達(dá)量相對較高。
乙烯合成相關(guān)基因:①DL-ACS相對表達(dá)量變動態(tài)變化存在較大的時期差異,球形胚(Stage5)的表達(dá)量最高,魚雷形胚(Stage7)的表達(dá)量最低;②DL-ACO表達(dá)量整體的變化趨勢呈字母“M”狀,不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(Stage3)和心形胚(Stage6)分別出現(xiàn)了峰值,松散型的胚性愈傷組織(Stage1)、球形胚(Stage5)以及子葉形胚(Stage8)的表
16、達(dá)量相對較低。
乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因:①DL-ETR1表達(dá)量整體的變化趨勢呈不規(guī)則“W”狀,松散型的胚性愈傷組織(Stage1)的表達(dá)量最高,心形胚(Stage6)階段的表達(dá)量最低;②龍眼體胚發(fā)生過程的8個階段均有DL-ERS1基因的表達(dá),但除了子葉形胚(Stage8)其它7個階段的表達(dá)量都很低,子葉形胚(Stage8)的表達(dá)量最高,魚雷形胚(Stage7)的表達(dá)量極低,幾乎不表達(dá)。
3.2龍眼體胚發(fā)生過程中激素
17、代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)情況相互之間的聯(lián)系
作為“可能”生長素受體之一的DL-4BP1基因整體轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢與生長素受體DL-TIR1基因相似。乙烯生物合成途徑中DL-ACS處于DL-ACO的上游,但兩者的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出幾乎完全相反的動態(tài)變化趨勢。同為乙烯受體家族I的DL-ETR1與DL-ERS1有著不同的表達(dá)模式。生長素受體DL-TIR1和乙烯合成相關(guān)基因DL-ACS兩者的變化趨勢基本相似。內(nèi)源IAA的整個變化趨勢
18、和DL-ACD基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢都呈雙峰型,只是IAA的兩峰值出現(xiàn)的時間比DL-ACO的轉(zhuǎn)錄水平稍提早了一個階段。與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DL-ARF基因與乙烯生物合成相關(guān)的DL-ACO整體轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢均呈不規(guī)則的“M”狀,第一個表達(dá)峰出現(xiàn)DL-ARF比DL-ACO稍早一個階段,DL-ACO表達(dá)量會比DL-ARF稍高。龍眼體胚中,DL-ARF、DL-ACO是否是生長素和乙烯互作的交叉點(diǎn),值得我們進(jìn)一步深入探索。
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