Hedgehog信號通路在肝再生過程中的表達(dá).pdf

1、本文構(gòu)建肝再生的動物模型，誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞再生及肝臟干/祖細(xì)胞增生，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、熒光定量PCR（real-time PCR）及免疫組化和免疫蛋白印跡（Western-blot）的方法檢測在肝再生過程中Hedgehog信號通路相關(guān)成份（Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli1、Gli2、Gli3）的表達(dá)。 目的： 1、初步探討在正常肝臟及肝再生過程中Hedgehog信號通路的表達(dá)情況； 2、

2、定量分析肝再生過程中Hedgehog信號通路的變化及其與肝再生動態(tài)改變之間的關(guān)系，論證Hedgehog信號通路是否激活并參與了肝臟再生過程； 3、從蛋白表達(dá)的水平檢測Hedgehog信號通路在肝再生過程中的表達(dá)，進(jìn)一步論證信號通路的激活。 材料和方法： 1、實(shí)驗動物： 雄性清潔級Fisher344大鼠96只，鼠齡5周，體重60-80g，由上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司提供，在南方醫(yī)院動物實(shí)驗中心SPF級飼養(yǎng)室

3、進(jìn)行喂養(yǎng)與實(shí)驗。動物飼養(yǎng)條件：溫度22-25℃，濕度（50±5）%，標(biāo)準(zhǔn)的12 h光照/12 h黑暗節(jié)律，標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水飼養(yǎng)。實(shí)驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組（Normal N）12只，倒千里光堿用藥組（restrosine R）21只，部分肝切除組（partial hepatectomy PH）21只和倒千里光堿/部分肝切除組（restrosine/partial hepatectomy R/PH）42只。 2、構(gòu)建

4、肝再生動物模型，誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞的代償性增生與肝臟干/祖細(xì)胞的增殖。 實(shí)驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，R組及R/PH組大鼠分別于第6周（鼠齡）和第8周（鼠齡）給予倒千里光堿（30 mg/kg，i．p），共2次。N組及PH組大鼠用以等體積生理鹽水代替倒千里光堿。 于第二次給藥后第5周（鼠齡13周），由專業(yè)外科人士對PH組及R/PH組大鼠行2/3部分肝切除手術(shù)。手術(shù)采用傳統(tǒng)的Higgins-Anderson部分肝切除方法，切除大鼠肝

5、臟左、右葉（中葉），約占全肝重量的68%。對N組和R組實(shí)施部分肝切除手術(shù)的基本操作，只是不進(jìn)行真正的肝葉切除（模擬手術(shù)），以校正可能由手術(shù)刺激，術(shù)中肝臟的處理，以及麻醉藥物的使用等引起的變化。 實(shí)驗動物在術(shù)后不同時間點(diǎn)（第2，3，4，7，14天，RJPH組延長到21天，30天）麻醉后處死。各葉肝臟分別切取3-5塊肝組織放入10%多聚甲醛固定，12-24小時后石蠟包埋。剩余的肝臟組織放入凍存管中，立刻置入液氮快速冷凍，然后放入-7

6、0℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?3、采用RT-PCR的方法檢測正常及再生肝臟組織均漿中Hedgehog信號通路各種成份（Shh，Ihh，Ptc，Smo，Gli1，2，3）的表達(dá)。 4、采用熒光定量PCR方法，定量檢測N組、R組、PH組與R/PH組大鼠之間肝臟Shh、Ihh、Ptc、Gli1及Gli3的表達(dá)，驗證RT-PCR的結(jié)果，論證Hedgehog信號通路的激活，并評價其與肝臟再生動態(tài)變化之間的關(guān)系。選擇這幾個指標(biāo)是因為Shh

7、、Ihh本身是Hedgehog信號通路的信號分子，Ptc、Gli1是通路激活的標(biāo)志，而Gli3的主要功能是在沒有Hedgehog信號刺激時，抑制目的基因的表達(dá)，使信號通路處于沉寂狀態(tài)；當(dāng)Hedgehog信號通路被激活時，其表達(dá)通常明顯下調(diào)。 5、肝臟組織切片免疫組化染色分析。從組織學(xué)水平比較各組間Shh、Ihh、Ptc、Gli1表達(dá)的差異，驗證RT-PCR及real-time PCR的結(jié)果，并論證Hedgehog信號通路在蛋白水

8、平的表達(dá)。 6、采用Western-blot的方法，檢測再生肝臟組織勻漿中Shh、Ihh、Ptc、Gli1的表達(dá)，并與N組、R組進(jìn)行對照，在蛋白水平檢測各組間相關(guān)蛋白表達(dá)的不同。 7、整理數(shù)據(jù)，采用析因設(shè)計方差分析（ANOVA for the factorial design）的方法，對Hedgehog信號通路相關(guān)成份及反映肝臟再生的指標(biāo)（肝臟重量、肝/體指數(shù)）在不同實(shí)驗組動物中，不同時間點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行了分析。組與組之間的

9、多重比較用LSD法進(jìn)行分析。用單因素方差分析的方法（one-way ANOVA），分析不同再生模式下Hedgehog信號通路相關(guān)成份隨時間的變化。所有數(shù)據(jù)利用SPSS13．0軟件進(jìn)行處理與統(tǒng)計學(xué)分析，P<0．05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、在正常大鼠肝臟有Hedgehog信號通路多種成份的表達(dá)。 RT-PCR測定結(jié)果顯示正常大鼠肝臟組織勻漿提取物中有Ihh，Ptc，Smo，Gli1，Gli2，Gli3 m

10、RNA的表達(dá)，而沒有Shh的表達(dá)。 肝臟組織切片免疫組化染色及Western-blot檢測均未能發(fā)現(xiàn)Ihh、Ptc、Gli1的表達(dá)。 2．不同再生模式下肝再生的動態(tài)變化及Hedgehog信號通路相關(guān)成份表達(dá)的定量分析 采用析因設(shè)計方差分析對Hedgehog信號通路相關(guān)成份（Ihh，Ptc，Gli1，Gli3）和反映肝臟再生變化的指標(biāo)（肝臟重量、肝/體指數(shù)）在不同實(shí)驗組大鼠中，不同時間點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行分析，組與組之間的

11、多重比較采用LSD法，并根據(jù)統(tǒng)計分析的結(jié)果繪制出不同肝再生模式下相關(guān)指標(biāo)的變化曲線圖。 3、部分肝切除術(shù)后肝再生過程中，Hedgehog信號通路的表達(dá)短暫增強(qiáng)。 在部分肝切除后肝再生時，肝重和肝/體指數(shù)在術(shù)后第4天開始明顯上升，至10～14天已基本接近正常肝臟的水平，反映出發(fā)育成熟肝細(xì)胞的巨大增殖潛能。 4、在倒千里光堿/部分肝切除術(shù)后，Hedgehog信號通路的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)。 倒千里光堿/部分肝切除術(shù)后

12、，LW、L/BW的變化明顯不同于PH后的改變，二者于術(shù)后第7～14天才開始出現(xiàn)緩慢的上升，但至第14天時仍明顯低于正常水平（約為正常肝臟重量的70～75%）。反映不同再生模式下，肝再生的程度是不一樣的。組織切片的H．E染色也證明了小肝細(xì)胞樣祖細(xì)胞的出現(xiàn)與增殖。 5、多種致病因素都可引起Hedgehog信號通路表達(dá)的改變 用real-time PCR的定量結(jié)果綜合分析多種肝臟損傷因素（藥物、手術(shù)及其聯(lián)合作用）對Hedgeh

13、og信號通路表達(dá)的影響時，發(fā)現(xiàn)在上述各種情況下，Ihh，Ptc，Gli1，Gli3的表達(dá)都會發(fā)生明顯的改變，差別只是在于變化的強(qiáng)度與持續(xù)的時間的不同。 結(jié)論： 1、Hedgehog信號通路在正常肝臟有低水平的表達(dá)，多種損傷因素都可以引起其表達(dá)的明顯改變。 2、在正常及再生肝臟，Hedgehog信號通路是通過Ihh而不是Shh發(fā)揮其生理作用的，二者在肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中可能具有不同的作用。 3、部分肝