熱應(yīng)激對巴馬香豬PBMC TLRs mRNA及TLRs介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響.pdf

1、為了探討熱應(yīng)激誘發(fā)動物免疫抑制的可能機(jī)理,本研究以巴馬香豬為試驗(yàn)材料,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA、放射免疫和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù),系統(tǒng)分析了:(1)巴馬香豬TLR2、TLR4基因和蛋白的分子特征；(2)熱應(yīng)激條件下體內(nèi)和體外PBMC內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性；(3)熱應(yīng)激發(fā)生不同時(shí)段PBMC TLR2、TLR4 mRNA、血漿皮質(zhì)醇和IL－2、IL－8表達(dá)水平；(4)原代培養(yǎng)的PBMC在熱打擊后不同時(shí)段TLR2、TLR4及其選擇性剪接體mR

2、NA和IL－12、IFN-γ表達(dá)水平的變化。研究結(jié)果如下:(1)巴馬香豬TLR2基因開放閱讀框長2358 bp,編碼785個(gè)氨基酸,該蛋白等電點(diǎn)為7.52,分子量為89.48 kD；與普通豬比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR2基因有15個(gè)堿基發(fā)生突變；與小鼠、狗、雞、牛、羊和人的同源性分別為73.4％、82.4％、59.5％、85.3％、84.6％和82.4％；TLR2膜外區(qū)蛋白為背側(cè)多個(gè)α螺旋和內(nèi)側(cè)多個(gè)β折疊平行交替排列構(gòu)成一個(gè)彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)；N

3、末端存在信號肽,且可能在21～22位氨基酸處存在裂解位點(diǎn)；胞外區(qū)有4個(gè)明顯的LRR,分別位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸區(qū)；膜外區(qū)含6個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)。
　　 (2)巴馬香豬TLR4基因開放閱讀框長2526 bp,編碼841個(gè)氨基酸,該蛋白等電點(diǎn)為6.58,分子量為96.4 kD；與普通豬比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4基因有5個(gè)堿基發(fā)生突變；與小鼠、狗、雞、牛、羊和人的同源性分別為71.9％

4、、81.5％、54.2％、86.4％、85.5％和81.9％；TLR4膜外區(qū)蛋白為背側(cè)多個(gè)α螺旋和內(nèi)側(cè)多個(gè)β折疊平行交替排列構(gòu)成一個(gè)彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)；N末端存在信號肽,且可能在23～24位氨基酸處存在裂解位點(diǎn)；胞外區(qū)有13個(gè)明顯的LRR,分別位于第53～74,77～100,101～124,149～173,174～192,201～225,372～393,398～429,446～469,470～494,495～518,519～541,543～

5、566位氨基酸區(qū)；膜外區(qū)含8個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)。
　　 (3)通過RT-PCR驗(yàn)證了TLR4-ASV mRNA的存在。并對其可能編碼的蛋白生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):可能的TLR4-ASV蛋白是一種截短的蛋白質(zhì),不存在信號肽結(jié)構(gòu),不屬于非經(jīng)典分泌蛋白,比正常TLR4蛋白少了6個(gè)LRR,存在跨膜結(jié)構(gòu),胞外結(jié)構(gòu)明顯縮短。
　　 (4)在熱應(yīng)激條件下,GeNorm和NormFinder分析得出的體內(nèi)PBMC中6種常用的內(nèi)參基因

6、的穩(wěn)定性由高到底依次為:ACTB/RPL>B2M>TBP>18s RNA>GAPDH和B2M+TBP>B2M>TBP>RPL>ACTB>18s RNA>GAPDH；體外培養(yǎng)的PBMC中5種常用的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到底依次為:TBP/B2M>ACTB>RPL>GAPDH和TBP+ACTB>ACTB>TBP>RPL>B2M>GAPDH。
　　 (5)在體內(nèi)模型中,對照組巴馬香豬PBMC TLR2 mRNA隨應(yīng)激時(shí)間延長,總體變化趨

7、勢不大,而應(yīng)激組。PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趨勢。相同時(shí)間點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn),除第一天外,應(yīng)激組TLR2 mRNA水平明顯升高(p<0.05)。而應(yīng)激組TLR4－A11 mRNA水平在第1、7、14和21天均極顯著高于對照組(p<0.01)。對照組血漿皮質(zhì)醇濃度總體變化不大,而應(yīng)激組皮質(zhì)醇濃度隨時(shí)間延長有上升的趨勢。在熱應(yīng)激第7、14和21天應(yīng)激組皮質(zhì)醇濃度顯著高于對照組(P<0.05)。對照組血漿IL－2水平呈先上升后下

8、降的趨勢,總體上變化并不大。而應(yīng)激組IL－2水平隨時(shí)間延長有上升趨勢。在熱應(yīng)激的第1天、第7天應(yīng)激組IL－2水平顯著低于對照組(P<0.05)。IL－8無論在應(yīng)激組或?qū)φ战M都有下降趨勢,但同一時(shí)間點(diǎn)兩者差異不顯著(P>0.05)。
　　 (6)在體外模型中,對照組巴馬香豬PBMC TLR2 mRNA水平總體變化不大,而熱應(yīng)激組PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趨勢。在應(yīng)激后恢復(fù)的第3小時(shí),應(yīng)激組TLR2 mRNA水

9、平顯著提高(p<0.05)且達(dá)到峰值。在第6、9小時(shí)應(yīng)激組TLR2mRNA水平有下降趨勢。對照組TLR4－A11 mRNA水平變化不大,而熱應(yīng)激組TLR4－A11mRNA水平有先上升后下降的趨勢。且在熱應(yīng)激后恢復(fù)的第3和第6小時(shí)顯著提高(p<0.05),第6小時(shí)達(dá)到高峰。對照組TLR4－ASV mRNA水平總體趨勢變化不大,熱應(yīng)激組TLR4－ASV mRNA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在應(yīng)激后恢復(fù)的第3小時(shí)應(yīng)激組TLR4－ASV mRN

10、A水平極顯著提高(p<0.001),且在第6和第9小時(shí)均顯著高于對照組(p<0.05)。對照組血漿IFN－γ水平隨著應(yīng)激時(shí)間的延長有降低的趨勢,而熱應(yīng)激組IFN－γ水平有先抑制后恢復(fù)的趨勢。在熱應(yīng)激后恢復(fù)的第1小時(shí)熱應(yīng)激組IFN－γ水平顯著下降(p<0.05),之后逐漸恢復(fù),到第3、6、9小時(shí)與對照組相比,差異均不顯著(p>0.05)。對照組血漿IL－12水平總體趨勢變化不大,熱應(yīng)激組血漿IL－12水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在熱應(yīng)激后

11、恢復(fù)的第1小時(shí)開始應(yīng)激組血漿IL-12水平開始上升,到第6小時(shí)達(dá)到高峰且顯著高于對照組(p<0.05),之后開始下降,到第9小時(shí)與對照組差異不顯著(p>0.05)。
　　 結(jié)論:(1)成功克隆了巴馬香豬PBMC TLR2、TLR4以及TLR4－ASV的mRNA。
　　 (2)B2M/TBP和ACTB分別是巴馬香豬PBMC體內(nèi)熱應(yīng)激模型和體外熱應(yīng)激模型中最適合的內(nèi)參基因。
　　 (3)熱應(yīng)激上調(diào)了巴馬香豬PBMC