粉紋夜蛾抗BtCrylAc毒素細胞與敏感細胞的差異蛋白初步分析.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，在芽孢形成過程中，可以產(chǎn)生伴孢晶體，這也是其殺蟲的主要活性成分。
　　 Bt合成的殺蟲晶體蛋白或轉(zhuǎn)Bt基因植物表達的毒素蛋白對多種害蟲具有特異性毒殺作用，被廣泛地用于防治農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲，是環(huán)境友好的生物農(nóng)藥。然而Bt殺蟲晶體蛋白能使害蟲產(chǎn)生高水平的抗性，這Bt資源的可持續(xù)利用有很大影響。因此深入了解昆蟲對Bt的抗性機制及其特點，才能制定出合理的

2、抗性治理策略，從而降低害蟲抗性的產(chǎn)生。
　　 本文在總結(jié)過去以蘇云金芽孢桿菌工業(yè)制劑篩選培養(yǎng)的離體昆蟲細胞來研究Bt抗性的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的基礎(chǔ)上，為了進一步探討單一的殺蟲晶體蛋白誘導(dǎo)昆蟲細胞產(chǎn)生抗性的規(guī)律和深入研究其抗性機制，我們以在大腸桿菌中表達的CrylAc毒素連續(xù)處理離體培養(yǎng)的粉紋夜蛾R-Tn－5B1細胞，目前已獲得一株對CrylAc毒素產(chǎn)生較高抗性的細胞系，并從細胞蛋白質(zhì)水平進一步探討了其抗性產(chǎn)生的原因。主要結(jié)果如下：<

3、br>　　 1.CrylAc毒素在大腸桿菌BL21中的轉(zhuǎn)化與表達
　　 將攜帶有CrylAc編碼基因的重組質(zhì)粒pHT304載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，擴大培養(yǎng)。將純化的殺蟲晶體蛋白酶和以50mM Na2CO3(pH10.5)溶液降解處理CrylAc毒素對粉紋夜蛾細胞有毒效。同時含CrylAc晶體編碼基因的大腸桿菌培養(yǎng)物提純殺蟲晶體蛋白，用純化的殺蟲晶體蛋白以堿性溶液降解后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，有毒性多肽(

4、MW66 KD左右)的存在。
　　 2.抗性粉紋夜蛾細胞系(R－Tn－5B1)的篩選及其抗性測定
　　 Tn－5B1細胞用CrylAc毒素連續(xù)處理，每5代以MTT法測定其抗性上升情況以及抗性粉紋夜蛾細胞R-Tn－5B1對CrylAc毒素的抗性比，離體生測結(jié)果表明，粉紋夜蛾Tn－5B1細胞對CrylAc毒素最敏感。第122代抗性衰退細胞的抗性比為128倍。繼續(xù)篩選到第124代時，抗性持續(xù)增加，抗性比為181.9倍。此后，抗

5、性的發(fā)展出現(xiàn)了一個大幅度的上升，篩選至第127代時抗性比已達634倍。目前篩選至第130代時抗性一直在增加，抗性比增加至1298.6倍。
　　 3.雙向電泳及圖譜分析
　　 根據(jù)ImageMaster2D Platinum6.0軟件分析，統(tǒng)計了凝膠上所有的差異蛋白點，并初步分析量的差異。分別以粉紋夜蛾敏感細胞和抗性細胞總蛋白雙向電泳圖譜和粉紋夜蛾抗CrylAc的R-Tn-5B1細胞總蛋白雙向電泳圖譜為參照，在抗性細胞的2

6、-DE總蛋白圖譜上檢測到的差異點主要集中在堿性端和分子量35.0-66.2KD之間且有2000個左右，經(jīng)軟件匹配和人工分析共得到表達量過量表達2-4倍的有24個，過量表達4倍以上的有14個；降低表達2-4倍有15個，降低表達4倍以上有18個，其中有顯著差異點有7個。這些差異蛋白質(zhì)可能與Bt抗性的產(chǎn)生存在某種直接或間接的關(guān)系。
　　 4.抗性粉紋夜蛾細胞和敏感細胞堿性磷酸酶活性的測定及比較
　　 磷脂酰肌醇錨定的堿性磷酸酶