阿維菌素4--OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表達(dá)及功能驗(yàn)證.pdf

1、阿維菌素是一種結(jié)構(gòu)新穎、農(nóng)畜兩用的重要生物源殺蟲(chóng)劑,對(duì)阿維菌素4"-OH進(jìn)行改造可以獲得藥效更高、殺蟲(chóng)譜更廣的甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)。當(dāng)前,甲維鹽的生產(chǎn)是以天然發(fā)酵產(chǎn)物阿維菌素為前體,通過(guò)化學(xué)方法合成,其中最關(guān)鍵的反應(yīng)步驟是將阿維菌素4"-OH氧化為4"-O。由于在對(duì)阿維菌素4"-OH氧化前后必須對(duì)分子中更加活躍的5-OH進(jìn)行保護(hù)和去保護(hù),且這個(gè)保護(hù)-去保護(hù)過(guò)程操作復(fù)雜、條件要求苛刻,導(dǎo)致了甲維鹽合成成本較高且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。

2、尋求廉價(jià)、高效、環(huán)保的生物催化劑,實(shí)現(xiàn)對(duì)阿維菌素4"-OH的位點(diǎn)特異性氧化,將大大簡(jiǎn)化甲維鹽的合成步驟,有利于甲維鹽的推廣應(yīng)用。據(jù)報(bào)道,一些鏈霉菌具有位點(diǎn)特異性氧化阿維菌素生成4"-O-阿維菌素的功能。筆者針對(duì)鏈霉菌進(jìn)行篩選,獲得一株能夠高效氧化阿維菌素4"-OH生成4"-O的不吸水鏈霉菌菌株ZB01(Streptomyces ahygroscopicus ZB01,CGMCC NO.2804),該菌株在72 h內(nèi)對(duì)初始濃度為1 g／L

3、的阿維菌素轉(zhuǎn)化率達(dá)36％,是已報(bào)道的轉(zhuǎn)化效率最高菌株的兩倍多,具有較大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。本研究以S.ahygroscopicus ZB01為出發(fā)菌株,展開(kāi)了一系列的研究。結(jié)果如下:
　　 1.利用同源克隆及染色體步移的方法,從S.ahygroscopicus ZB01菌株基因組中克隆到一條cyp107z亞家族基因的同源基因,其全長(zhǎng)1290 bp,共編碼429個(gè)氨基酸殘基,經(jīng)國(guó)際P450命名委員會(huì)命名為cyp107213,是cyp1

4、07z基因亞家族的第13個(gè)新成員。
　　 2.利用多拷貝型大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139,建立了組成型啟動(dòng)子ermE*P調(diào)控下的cyp107z13鏈霉菌表達(dá)載體,采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌TK54(Streptomyces lividians TK54)中,經(jīng)CO光譜分析和HPLC檢測(cè),證實(shí)cyp107z13基因在S.lividiansTK54中成功表達(dá),并且表達(dá)的CYP107213能利用S.livid

5、arts TK54的電子傳遞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)電子傳遞,完成位點(diǎn)特異性氧化阿維菌素4"-OH生成4"-O-阿維菌素的反應(yīng)。
　　 3.對(duì)上述S.lividians TK54重組菌的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示,培養(yǎng)基種類(lèi)、pH值和菌體的活力狀態(tài)對(duì)重組茵轉(zhuǎn)化阿維菌素的效率有不同程度的影響。其中pH6.0、改良ISP-2液體培養(yǎng)基以及活化細(xì)胞有利于提高重組菌轉(zhuǎn)化阿維菌素的效率。
　　 4.利用pET28a載體,構(gòu)建cyp107z13的重

6、組質(zhì)粒pET-z13,將pET-z13轉(zhuǎn)入Escherichia coliBL21(DE3)中,經(jīng)EIJSA及CO差光譜法檢測(cè),證實(shí)CYP107213已在E.coli BL21(DE3)中成功表達(dá),并采用Ni-柱親和層析法純化了帶His6標(biāo)簽的活性CYP107Z13重組蛋白。
　　 5.利用純化的CYP107Z13重組蛋白,與鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶構(gòu)建體外重組酶催化體系,通過(guò)測(cè)定體系中NADPH的消耗,獲得了該重組蛋白以阿