西蘭花CYP83A1基因的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、西蘭花（Brassica oleracea var.italica）又名花椰菜，是十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬（Brassica）植物中的一種重要植物，原產(chǎn)地為意大利。由于西蘭花富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素和胡蘿卜素等，且營養(yǎng)成份居于同類蔬菜之首，因此具有“蔬菜皇冠”的美譽(yù)。西蘭花中含有豐富的芥子油苷，而西蘭花花球中的脂肪族芥子油苷所占比例最高，且脂肪族芥子油苷中的4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷（蘿卜硫苷）其降

2、解產(chǎn)物蘿卜硫素具有顯著的抗癌活性。西蘭花中含有的蘿卜硫素(sulforaphane)是異硫氰酸酯衍生物中具有最強(qiáng)抗癌活性的一種物質(zhì)，對(duì)乳腺癌、胃癌作用明顯，因而備受關(guān)注。因此，利用遺傳學(xué)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高西蘭花中脂肪族芥子油苷含量，使得蘿卜硫素的含量增加，從而獲得高抗病、抗癌的西蘭花對(duì)于科研和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義。
　　本文以西蘭花為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)前期西蘭花轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性引物。利用RT-PC

3、R技術(shù)克隆得到西蘭花CYP83A1基因的CDS序列，命名為BoCYP83A1。BoCYP83A1的基因序列、蛋白序列、理化性質(zhì)等相關(guān)信息是利用生物信息學(xué)中的相關(guān)生物軟件進(jìn)行分析獲得，通過生物學(xué)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確BoCYP83A1基因在十字花科植物基因組中的進(jìn)化地位。以BoCYP83A1基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建35S∷BoCYP83A1植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法進(jìn)行擬南芥侵染，采用PCR及RT-PCR技術(shù)對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行DNA

4、與RNA水平的檢測。利用超高效液相色譜法(UPLC)對(duì)35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行芥子油苷種類與含量的測定，探究BoCYP83A1基因在西蘭花脂肪族芥子油苷合成途徑中的作用。為真正實(shí)現(xiàn)西蘭花在蘿卜硫素產(chǎn)量提高上提供充足的理論依據(jù)，為最終獲得高抗癌活性的西蘭花品種奠定基礎(chǔ)。
　　本研究中得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.首次獲得西蘭花CYP83A1的CDS序列
　　通過RT-PCR方法，首次從西蘭花四周

5、大葉片中克隆獲得CYP83A1的CDS序列，并命名為BoCYP83A1。
　　2.BoCYP83A1的生物信息學(xué)分析
　　BoCYP83A1基因CDS序列全長為1509bp，此基因共編碼502個(gè)氨基酸（GenBank序列號(hào)為KM111290）。BoCYP83A1的蛋白分子式、分子量大小和等電點(diǎn)分別為C2600H4058N674O736S29、57.47 kD和7.1，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型蛋白;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與

6、二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相同;BoCYP83A1含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白;BoCYP83A1含有51個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，N-糖基化位點(diǎn)不存在，其中包含4個(gè)Tyr位點(diǎn)、6個(gè)Thr和Ser位點(diǎn)以及16個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。氨基酸序列分析表明它與與油菜、大白菜、蘿卜、小白菜、黑芥菜、玉山筷子芥和擬南芥的氨基酸同源性分別為98％、98％、97％、97％、92％、89％、88％。BoCYP83A1基因的蛋白序列與7個(gè)物

7、種的CYP83A1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明西蘭花與這7種植物具有共同起源，但功能上存在分支。
　　3.植物超表達(dá)載體的構(gòu)建
　　對(duì)pCAMBIA230035Su進(jìn)行改造后將nptⅡ?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，利用CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BoCYP83A1過量表達(dá)。
　　4.35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測
　　利用含有100mg/ml卡那霉素的2/1MS培養(yǎng)基篩選，初步獲得15株擬南芥抗性苗。其中，DNA水平

8、PCR檢測陽性植株為14株。以上述陽性植株為供試材料進(jìn)行RT-PCR檢測，顯示4個(gè)樣品為陽性，說明這四株陽性植株是35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。
　　5.35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因植株芥子油苷含量的測定
　　利用超高效液相色譜系統(tǒng)檢測芥子油苷組分及含量，檢測結(jié)果表明在35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中脂肪族芥子油苷總含量升高，吲哚族和芳香族芥子油苷總含量下降。其中3MS0P、4MS0B、4MTB

9、、5MS0P、6MS0H等脂肪族芥子油苷的含量都有所上升，其中4MS0B(4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷)和4MTB(4-甲硫丁基脫硫芥子油苷)變化明顯。35S∷BoCYP83A1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的吲哚族芥子油苷I3M（吲哚基-3-甲基芥子油苷）和1MOI3M（1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷）含量降低，4MOI3M(4-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷)無含量變化，同時(shí)芳香族芥子油苷(Benzyl)含量下降。上述結(jié)果說明，BoCYP83A1