桑樹MAPK基因家庭信息分析與功能研究.pdf

1、生物和非生物逆境脅迫因子（如病原侵害、干旱、高鹽和高低溫等）嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)量和品質(zhì)。植物對(duì)脅迫應(yīng)答響應(yīng)是一個(gè)涉及基因、信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及基因表達(dá)產(chǎn)物協(xié)同參與的過程，這個(gè)過程又分為到4個(gè)階段:植物對(duì)脅迫信號(hào)的感知、脅迫信號(hào)的傳遞、膜受體對(duì)脅迫信號(hào)的識(shí)別與傳導(dǎo)和相關(guān)抗逆基因的表達(dá)。在這其中，蛋白激酶是植物體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)酶，通過膜受體感知外界環(huán)境脅迫信號(hào)，引起細(xì)胞內(nèi)一些離子和分子濃度改變，激活不同蛋白磷酸化途徑。而促分裂原活

2、化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，它是普遍存在于真核生物中的一類保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和多種生物、非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用。
　　桑樹是一種對(duì)環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性的多年生生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種，具有耐鹽堿、耐旱、耐澇和耐寒等多種特性。但其逆境生理、生化和分子生物學(xué)研究極少。關(guān)于桑樹抗性的研究主要集中在抗性種子資源的篩選及抗性生理指標(biāo)的測(cè)定，桑樹抗性基因

3、的研究并不多見。雖然MAPK在一些植物中已經(jīng)被鑒定并驗(yàn)證功能，但是在公共數(shù)據(jù)庫（如NCBI，EMBL等）中沒有桑樹MAPK的相關(guān)報(bào)道。隨著川?；蚪M的完成，使在全基因組水平分析桑樹MAPK抗性基因家族成為可能，這對(duì)于探明MAPK脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)理以及植物對(duì)生物和非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制具有重要意義，為桑樹分子改良提供研究基礎(chǔ)。
　　本研究基于川?；蚪M數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)方法對(duì)預(yù)測(cè)的桑樹MAPK基因家族根據(jù)其氨基酸序列和保守基序進(jìn)行

4、分類和系統(tǒng)發(fā)生分析，從中鑒定出47個(gè)桑樹MAPK(MnMAPK)家族基因:32個(gè)MnMAPKKK、5個(gè)MnMAPKK和10個(gè)MnMAPK基因。并對(duì)其中的10個(gè)MnMAPK基因的基因結(jié)構(gòu)、上游啟動(dòng)子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物中MAPK蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;并對(duì)其克隆序列與川桑基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析;以生長(zhǎng)2個(gè)月（高度約25cm）的湖桑幼苗為材料，對(duì)其進(jìn)行不同的脅迫（高溫，低溫，高鹽和干旱）和信號(hào)分子(ABA，SA，H2O2

5、和MeJA)處理，通過qRT-PCR分析桑樹MAPK基因在不同脅迫誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況;基于脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜篩選出候選的MnMAPK6基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，構(gòu)建植物超量表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行高溫，干旱，高鹽，H2O2等處理，觀察其對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫耐受情況。本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　1、川桑MAPK基因家族生物信息學(xué)分析和克隆
　　利用生物信息學(xué)方法在

6、川?；蚪M中鑒定得到47個(gè)桑樹MAPKs家族基因:32個(gè)MnMAPKKK、5個(gè)MnMAPKK和10個(gè)MnMAPK基因。并對(duì)其中的10個(gè)MnMAPK基因的基因結(jié)構(gòu)、上游啟動(dòng)子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物中MAPK蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，克隆了10個(gè)MnMAPK基因，序列驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)川?；蚪M數(shù)據(jù)庫中MnMAPK2比川桑cDNA中克隆得到的MnMAPK2全長(zhǎng)cDNA缺失15個(gè)核苷酸堿基，MnMAPK8存在兩種剪接形式。MnMAPK基因

7、CDS大小介于1107 bp到1902 bp之間，它們編碼的蛋白質(zhì)大小范圍為368至633個(gè)氨基酸(aa)，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量在42.4 kD和70.9 kD的之間，等電點(diǎn)大小介于5.0到9.28之間。通過桑樹MAPK氨基酸序列多重序列比與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，桑樹MAPK分布在A-E組。
　　2、桑樹MAPK基因非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　對(duì)川桑MAPK家族的10個(gè)基因設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以生長(zhǎng)兩個(gè)月的湖桑32號(hào)幼苗為材

8、料，進(jìn)行高溫、低溫、干旱、高鹽非生物脅迫處理和ABA、SA、H2O2和MeJA四種信號(hào)分子處理，提取對(duì)照組和處理組材料的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)桑樹MAPK基因在脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，桑樹MnMAPKs基因可以受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，不同的桑樹MAPK基因?qū)Σ煌拿{迫處理有不同的脅迫應(yīng)答模式。
　　3、川桑MnMAPK6基因亞細(xì)胞定位與功能研究
　　MnMAPK6在桑樹根、莖和葉三個(gè)組織在不同的非生物脅迫

9、和不同的時(shí)間段處理后的表達(dá)模式不同，可以響應(yīng)多種脅迫，暗示MnMAPK6參與了桑樹非生物脅迫響應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　構(gòu)建35 S-MnMAPK6∷ EGFP瞬時(shí)表達(dá)載體，同時(shí)構(gòu)建35S-EGFP表達(dá)載體作為對(duì)照，用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示MnMAPK6融合蛋白被定位在細(xì)胞核中。
　　構(gòu)建MnMAPK6植物超量表達(dá)載體，浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得轉(zhuǎn)基因植株。不同的過表達(dá)植株GUS的表達(dá)量不同，并且表現(xiàn)出一定的組織差異