苜蓿MtERN1~3等結(jié)瘤素基因的克隆與表達載體構(gòu)建.pdf

1、結(jié)瘤素基因(Nodulin Gene)是一類參與豆科植物共生固氮作用的植物基因,這些基因的表達產(chǎn)物只存在于根瘤菌感染產(chǎn)生的根毛、侵入線和根瘤細胞中。它們對于根瘤的形成與維持、固氮活性的保護以及固氮產(chǎn)物的代謝等都有重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個關(guān)鍵的結(jié)瘤素基因在根瘤發(fā)育早期表達,參與“根瘤菌——根毛”相互作用及根瘤形態(tài)發(fā)生過程,對植物與根瘤菌之間的信息傳遞、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有著重要作用。但是,它們的工作機理仍有待進一步闡明。這些關(guān)鍵

2、結(jié)瘤素基因在轉(zhuǎn)化到非豆科植物中后,是否能發(fā)揮相應(yīng)的功能,也需要進一步的探索。
　　 通過對豆科植物突變體的研究,揭示了共生固氮體系的信號通路機制,明確了許多共生固氮相關(guān)蛋白或基因的功能。DMI1基因編碼一個位于細胞核膜離子門通道蛋白;DMI2編碼一個富含亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域的類受體激酶(LRR-RLK);DMI3編碼一種依賴鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶CCaMK;NSP1、NSP2基因編碼結(jié)瘤信號轉(zhuǎn)導通路因子(Nodulation signa

3、ling pathway)NSP1和NSP2,后者是早期根瘤信號轉(zhuǎn)導中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,受結(jié)瘤因子(NF)誘導引起信號通路下游的應(yīng)答反應(yīng),包括Ca2+濃度的變化。ERN1、ERN2和ERN3屬于同一家族基因,其轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物ERN1、ERN2和ERN3都作用于ENOD11的啟動子,作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與到信號通路中;EFD(ERF requiredfor nodule differentiation)是連接根瘤形成早期和晚期階段的一個關(guān)鍵調(diào)

4、控轉(zhuǎn)錄因子,它能夠抑制細胞分裂素的初級受體基因MtRR4,阻遏根瘤形成,與此同時,它還促進已起始根瘤的分生組織細胞的分化;MtLYK3和LjNFR5等基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為結(jié)瘤因子受體,與結(jié)瘤因子結(jié)合后控制侵入線的形成和根毛卷曲。
　　 國內(nèi)外在生物固氮方面的研究較為廣泛,很多學者將固氮相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入非豆科或豆科植物,以探討單個基因的功能和對生物固氮功能的影響。但如果要將豆科植物的共生固氮機制移植到非豆科植物,就需要將豆

5、科植物共生固氮機制中必須的基因全部導入進非豆科植物。本實驗針對豆科植物與根瘤菌識別和形成侵入線過程中的早期信號傳導機制,從苜蓿基因組中克隆7個參與共生固氮早期信號傳導途徑的調(diào)控基因,并構(gòu)成多價基因表達載體,以期今后導入非豆科植物后探討早期信號傳導途徑移植的可能性。
　　 主要實驗結(jié)果如下:
　　 1、采用高保真的PrimStar HS DNA聚合酶或TaKaRa LA Taq DNA聚合酶進行PCR擴增,從苜蓿基因組DN

6、A中克隆MtNSP1(3617 bp)、MtNSP2(3381 bp)、MtDM113(5903 bp)、MtENOD40(4119 bp)、MtERN1(3951 bp)、MtERN2(3123 bp)和.MtERN3(2561 bp)等基因,測序后分析證實與GenBank公布的序列相一致。
　　 2、以pCAMBIA1302載體為基礎(chǔ),經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、片段連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),將苜蓿結(jié)瘤素基因MtDM13、MtERN