雞XOD亞基的原核表達(dá)、定位及其在NIBV感染后的蛋白表達(dá)量分析.pdf

1、黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)是參與機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)XOD在機(jī)體內(nèi)的病理過程中也起到了重要作用。本試驗(yàn)參照GenBank中收錄的G.gallus XOD基因序列(D13221.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增一段XOD亞基序列(987 bp)，通過基因克隆，將目的基因插入到PMD-18-T載體上。確定正確插入后，將酶切后的目的基因連接至pET-32a(+)載體，構(gòu)建雞XOD原核表達(dá)載體

2、pET-XOD，并轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)重組雞XOD蛋白。通過鎳柱親和層析的方法純化重組雞XOD蛋白，以復(fù)性濃縮后的重組雞XOD蛋白作為抗原制備抗體血清，使用間接EHSA和Westemblot的方法分別確定抗體的效價(jià)和特異性。通過利用免疫組化和免疫熒光的方法，使用本試驗(yàn)中制備的多克隆抗體，定位雞XOD在肝、腎組織中的分布。通過利用Western blot相對(duì)定量蛋白的方法，檢測(cè)雞在感染腎型傳染性支氣管炎(N

3、IBV)后腎組織中XOD和Bcl-2蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果表明:雞XOD原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，并分離純化到了高濃度的重組雞XOD蛋白(大小約54 KDa)。用該蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)約1∶102400，可特異性地檢測(cè)雞肝組織中的XOD。免疫組化和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示雞XOD主要存在于肝、腎組織細(xì)胞胞質(zhì)之中。同時(shí)，蛋白定量結(jié)果表明在雞NIBV感染后會(huì)引起腎組織中XOD和Bcl-2的蛋白表達(dá)量的顯著上升(P＜0.05)。