Bacillus amyloliquefaciens B3生防促生相關(guān)基因和內(nèi)生質(zhì)粒pBSG3的研究及高效生防工程菌的構(gòu)建.pdf

1、芽孢桿菌好氧或兼性厭氧，產(chǎn)芽孢，廣泛存在于自然界中，由于其生長(zhǎng)速度快，次生代謝產(chǎn)物豐富，利用價(jià)值高以及對(duì)人畜安全等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中．本實(shí)驗(yàn)室早年篩選并開(kāi)發(fā)了芽孢桿菌生防制劑“麥豐寧”，該茵劑的有效成分為芽孢桿菌B3．本研究應(yīng)用多相分類(lèi)方法、消減抑制雜交技術(shù)、全基因組測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)芽孢桿菌B3進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，主要內(nèi)容包括，1）確定B3菌株的分類(lèi)地位；2）揭示B3的生防促生機(jī)理；3）B3菌株內(nèi)生隱蔽質(zhì)粒的研究；4

2、）Harpin蛋白和生防芽孢桿菌相結(jié)合的高效生防工程菌的研發(fā)．主要研究結(jié)果如下：
　　 1．多相分類(lèi)體系，即將形態(tài)、生理生化、脂肪酸分析、分子鑒定等方法相結(jié)合，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行較準(zhǔn)確的鑒定，本研究著重采用分子生物學(xué)手段將早期實(shí)驗(yàn)室分離和經(jīng)表型鑒定的生防芽孢桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)。11株生防芽孢桿菌首先進(jìn)行脂肪酸甲酯（fattyacid methyl ester, FAME）鑒定，接著進(jìn)行16S rDNA和gyrB基因序列擴(kuò)增和分析鑒定，同時(shí)

3、進(jìn)行基因組BOX-PCR指紋圖譜分析鑒定，綜合脂肪酸甲脂鑒定和一系列分子鑒定結(jié)果，將11株生防芽孢桿菌鑒定為：短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)1株，蠟樣芽孢桿菌組群（Bacillus cereus）2株，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）4株，萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）1株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）3株，“麥豐寧”有效成分芽孢桿菌B

4、3最終被鑒定為解淀粉芽孢桿菌．此外，通過(guò)基質(zhì)協(xié)助激光解吸附/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time offlight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這11株生防菌都能夠產(chǎn)生一種或多種抑制真菌的脂肽化合物(如Fengycin和Bacillomycin D)或抑制細(xì)菌的聚酮類(lèi)化合物（如Difficidin，Bacil

5、laene等）．
　　 2．我們應(yīng)用差減雜交技術(shù)、全基因組測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)以揭示解淀粉芽孢桿菌B3生防和促生的機(jī)理。將解淀粉芽孢桿菌B3與不具生防能力的芽孢桿菌模式菌株枯草芽孢桿菌168進(jìn)行差減雜交，共得到了49個(gè)B3特異片段，其中包含了在生防芽孢桿菌中起主要作用的非核糖體肽類(lèi)抗生素合成酶編碼基因片段，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)了新的非核糖體合成酶編碼基因和一個(gè)內(nèi)生質(zhì)粒。我們?cè)诘聡?guó)比勒菲爾德大學(xué)進(jìn)行了B3全基因組測(cè)序，在此平臺(tái)上，我們將新

6、發(fā)現(xiàn)的非核糖體合成酶基因簇進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其包括7個(gè)模塊，其中有兩個(gè)是負(fù)責(zé)半胱氨酸的縮合，一個(gè)是天冬氨酸或酰胺的縮合，另外四個(gè)模塊沒(méi)有預(yù)測(cè)出結(jié)果，此外，我們對(duì)B3基因組中所有的非核糖體肽類(lèi)抗生素的合成酶和促生相關(guān)基因進(jìn)行了分析．結(jié)果顯示，B3中含有8個(gè)非核糖體肽合成酶基因簇、1個(gè)二肽類(lèi)抗生素編碼基因簇，還有參與生物膜形成和定殖相關(guān)基因簇（EPS，PGA operon），以及能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的吲哚乙酸合成關(guān)鍵基因和2，3-丁二醇合成

7、相關(guān)基因等。
　　 3．具有良好拮抗和促生作用的Bacillus amyloliquefaciens B3舍有一個(gè)可以自我復(fù)制的內(nèi)生隱蔽性質(zhì)粒pBSG3。對(duì)該質(zhì)粒完全測(cè)序，結(jié)果顯示，其大小為8439bp，GC含量40.3％．序列分析和比對(duì)顯示，pBS03中含有7個(gè)可預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框（ORF），分別是repB3，mobB3，rapQ，phrQ, pgsR和兩個(gè)未知ORFs（Drflc和orf2）．通過(guò)Southem雜交和復(fù)制元件的

8、序列分析，最終確定pBSG3采取滾環(huán)式復(fù)制方式(Rolling-circle mechanism)進(jìn)行復(fù)制，屬于滾環(huán)式復(fù)制質(zhì)粒家族?；騧obB3的存在預(yù)示質(zhì)粒pBSG3具有在芽孢桿菌群體中可以轉(zhuǎn)移的特性．我們對(duì)質(zhì)粒中的RapQ-PhrQ系統(tǒng)進(jìn)行了初步的功能研究，該系統(tǒng)參與了芽孢桿菌的孢子形成的過(guò)程，RapQ蛋白能夠推遲孢子的形成。此外，我們將pBSG3的部分或全部復(fù)制單元克隆到pMD18-T載體，成功開(kāi)發(fā)了穿梭載體pTRD和pTRDS

9、，并進(jìn)行了兩個(gè)質(zhì)粒的穩(wěn)定性測(cè)定，結(jié)果顯示，pTRDS的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性都非常好。隨后，我們將本實(shí)驗(yàn)室的Harpin蛋白編碼基因hpal克隆到質(zhì)粒pTRDS，并轉(zhuǎn)入了芽孢桿菌OKB105中，利用RT-PCR的方法在RNA水平檢測(cè)到了hpal的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，內(nèi)生質(zhì)粒pBSG3不但可能是芽孢桿菌種群中遺傳物質(zhì)的交換工具，而且可以被用來(lái)開(kāi)發(fā)和利用成為芽孢桿菌研究的克隆、表達(dá)載體．
　　 4．本著將具有促生防病效果的Harpin蛋白和產(chǎn)

10、非核糖體肽類(lèi)抗生素的生防芽孢桿菌相結(jié)合的原則，將HpaGxooC編碼基因hpal與可產(chǎn)生多種脂肽類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物的根圍促生拮抗解淀粉芽孢桿菌FZB42相結(jié)合，創(chuàng)制更具有價(jià)值的生防制劑．在本研究中，我們構(gòu)建了pGAprEHS、pUNprEKHS兩個(gè)重組表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)化到解淀粉芽孢桿菌FZB42中，利用雙交換同源重組技術(shù)，將hpal分別整合到FZB42的蛋白水解酶編碼基因aprE和nprE位點(diǎn)．這兩個(gè)重組載體都含有P43強(qiáng)啟動(dòng)子和np

11、rB信號(hào)肽組件，這有助于Harpin蛋白的連續(xù)表達(dá)和向外分泌。經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證和RT-PCR的分析，結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了雙拷貝Harpin外泌工程菌株FZBHaxpin，且hpal能在RNA水平上正常轉(zhuǎn)錄。隨后，我們對(duì)野生菌FZB42，工程菌FZBHarpin和雙突變菌株FZBAN分別進(jìn)行了溫室和大田實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了其促生和防治水稻白葉枯病的效果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明FZBHarpin具有比其出發(fā)菌株FZB42更好的促生和生防效果；同時(shí)，我們觀察到a