黃瓜抗黑星病基因Ccu的精細定位與圖位克隆及黃瓜與黑星菌互作的表達譜分析.pdf

1、黃瓜黑星病是黃瓜的主要病害之一,針對黃瓜抗黑星病基因的研究對明確黃瓜抗病機制和抗病育種都具有重要的意義。
　　 本研究以高感黑星病黃瓜材料9930(中國華北保護地栽培品種)、高抗黑星病材料9110gt(歐洲溫室品種)、Gy14(美國加工品種)、Hardwickii(印度野生黃瓜)等為試材,對黃瓜全基因組水平NBS-encoding(Nucleotide banding site encoding)基因進行分析,對黃瓜抗黑星病基因

2、進行遺傳、定位和克隆研究,并對黃瓜與黑星病菌的親和與不親和互作進行研究,獲得如下研究成果:
　　 1、全基因組水平分析發(fā)現(xiàn)9930、Gy14、Hardwikii中分別含有NBS-encoding基因58、60、60個,在基因組上的密度為20個／100 Mb基因組,為擬南芥、水稻、楊樹等平均密度的1／5,且NBS結(jié)構(gòu)內(nèi)Kinase-2、Kinase-3、GLPL等保守域與其它幾個物種相比,具明顯的氨基酸不一致現(xiàn)象,LRR區(qū)域則高度

3、保守。通過手工注釋的方法發(fā)現(xiàn)三個黃瓜基因組中7個直系同源基因發(fā)生了移碼突變、1個基因發(fā)生提前終止密碼子突變、1個基因缺失突變,說明不同黃瓜品種中抗病基因差異大。
　　 2、精細定位了黃瓜抗黑星病基因Ccu,發(fā)現(xiàn)Ccu區(qū)域存在一個緊密連鎖的抗病基因簇。利用148個株系的F9-RILs群體和2000個單株的F2群體為試材,采用分子標記、遺傳連鎖作圖等技術(shù)將Ccu定位到黃瓜2號染色體短臂末端一個長度為140 kb的DNA區(qū)域,此區(qū)域包

4、含一個緊密連鎖的抗病基因簇,抗病基因簇中有三個基因呈串聯(lián)相鄰排列(Csa006756、Csa006757、Csa006758)。通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)該抗病簇與甜瓜、擬南芥、楊樹等同源區(qū)域具有共線性(圖4-6、4-7),表明此同源抗病基因簇由一個古老的抗病區(qū)域進化而來。
　　 3、圖位克隆了Ccu候選基因。通過構(gòu)建黃瓜抗黑星病品種9110gt BAC文庫,篩選出包含目的抗病簇的BAC克隆H77-J7和H74-D1,進一步構(gòu)建了長度

5、為11 kb的亞克隆文庫,篩選出包含候選基因起始密碼子上游到終止密碼子下游各約2.5 kb的目的亞克隆Csa00672756—1、Csa006757-1、Csa006758-1,可用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因驗證其功能。
　　 4、通過黃瓜與黑星菌親和與不親和互作的表達譜分析,揭示了黃瓜抗黑星病的機制。以黃瓜高抗黑星病品種Gy14和高感黑星病品種9930為試材,利用高通量的測序技術(shù)對接種病菌材料及其對照材料進行表達譜分析,發(fā)現(xiàn)抗病品種在接種2

6、4小時后已全面上調(diào)了細胞內(nèi)的2條HR(Hypersensitive Reaction)反應(yīng)程序和1條PR(Pathogenesis related)基因相關(guān)的增強防御程序(圖5-11、表5-5)中的編碼關(guān)鍵因子基因。與抗病材料相比,感病材料中只部分啟動了第三條WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與的PR基因防御程序,其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達水平顯著上調(diào),但其下游的PR基因卻沒有上調(diào)表達,植物未進入對病害的防御狀態(tài)(圖5-11、表5-5)。