黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因的發(fā)掘及克隆.pdf

1、霜霉病是黃瓜葉片主要病害之一，自1868年在古巴被發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已危害全球70多個(gè)國(guó)家的黃瓜生產(chǎn)。目前，對(duì)于黃瓜霜霉病抗性相關(guān)的研究較多，雖取得了一定進(jìn)展，但未有重大突破。已經(jīng)報(bào)道的QTL位點(diǎn)分散在chr1、chr5和chr6上，缺少緊密連鎖且簡(jiǎn)便實(shí)用的分子標(biāo)記，并且由于育種實(shí)踐中不同種質(zhì)資源的遺傳背景存在差異，限制了這些標(biāo)記在育種中的應(yīng)用。另外，抗病基因或QTL的精細(xì)定位和圖位克隆進(jìn)展緩慢，至今尚未見到成功克隆黃瓜霜霉病抗病基因或QTL

2、并完成功能驗(yàn)證的報(bào)道，無法滿足在育種實(shí)踐中輔助選擇和種質(zhì)創(chuàng)新的需要。如何進(jìn)一步深入挖掘黃瓜抗霜霉病基因，加速抗病分子育種進(jìn)程，成為黃瓜抗病育種亟待解決的課題。
　　本研究從以下兩個(gè)方面開展工作：
　　一方面，以抗性基因?yàn)檠芯磕康摹＠酶呖裹S瓜霜霉病的純合自交系K8和感病材料新泰密刺選系K18為親本，構(gòu)建含有86個(gè)單株的RIL群體，分別在苗期、成株期對(duì)群體進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)合構(gòu)建的分子標(biāo)記遺傳圖譜，對(duì)苗期和成株期的霜霉病抗性進(jìn)

3、行相關(guān)性分析，對(duì)黃瓜霜霉病抗性基因進(jìn)行QTL定位，并在定位區(qū)域內(nèi)進(jìn)行候選基因分析，確定11個(gè)與抗性相關(guān)的基因，在兩親本間對(duì)其進(jìn)行克隆和序列分析。
　　另一方面，研究霜霉病感病基因。通過同源序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定黃瓜霜霉病感病候選基因?？寺【哂胁煌z傳背景、不同抗性的15份黃瓜材料的感病候選基因，比較克隆序列，尋找差異。并對(duì)有突變的和無突變的基因序列進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，確定變異點(diǎn)是否引起氨基酸的變化。同時(shí)對(duì)該候選基因進(jìn)

4、行一系列的生物信息學(xué)分析：（1）預(yù)測(cè)其基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域（2）與已知功能的擬南芥同源感病基因氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)（3）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　具體研究結(jié)果如下：
　?。?）利用2112對(duì)SSR引物對(duì)親本K8和K18進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到112個(gè)多態(tài)性標(biāo)記；將多態(tài)性標(biāo)記在RIL群體上進(jìn)行SSR分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后，使用Join map軟件構(gòu)建分子連鎖圖譜。圖譜包含7個(gè)連鎖群,與黃瓜的7條染色體對(duì)應(yīng)，86個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)度513.2

5、cM，分子標(biāo)記之間的平均遺傳距離為5.97cM。
　?。?）對(duì)RIL群體進(jìn)行霜霉病苗期人工接種抗病性調(diào)查和田間成株期抗病性調(diào)查，利用MapQTL4.0的復(fù)合區(qū)間作圖法（MQM）作圖，結(jié)合RIL群體的病情指數(shù)進(jìn)行QTL定位分析，結(jié)果三次試驗(yàn)均在chr5上檢測(cè)到2個(gè)QTL位點(diǎn)dmQTL5.1和dmQTL5.2。dmQTL5.1在標(biāo)記SSR16110-SSR11012之間，LOD值為14.17，貢獻(xiàn)率高達(dá)53.6％。dmQTL5.2在標(biāo)

6、記SSR26904-SSR14194之間，LOD值為8.85，貢獻(xiàn)率達(dá)到31.1%。另外，苗期接種數(shù)據(jù)的定位結(jié)果還在chr6找到一個(gè)微效位點(diǎn)dmQTL6.1，LOD值為1.72，貢獻(xiàn)率為9.4%。
　?。?）春季，秋季的成株期霜霉病抗性與苗期的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，相關(guān)系數(shù)分別為：0.61542和0.67648。
　?。?）利用生物信息學(xué)，在主效QTL位點(diǎn)dmQTL5.1的區(qū)域進(jìn)行基因及功能的預(yù)測(cè)，在物理范圍約4319kb

7、的兩標(biāo)記SSR16110-SSR11012之間，共有397個(gè)候選基因。其中，與抗性相關(guān)的基因主要有11個(gè)富含LRR的抗病蛋白基因；10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白基因；20個(gè)鋅指蛋白基因；1個(gè)逆境調(diào)控蛋白基因。
　?。?）設(shè)計(jì)引物克隆了11個(gè)富含LRR的抗病蛋白基因的DNA全長(zhǎng)，測(cè)序并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明11個(gè)候選基因中，有兩個(gè)基因Csa5M464830.1和Csa5M495930.1在兩親本之間存在序列上的差異，且會(huì)改變相應(yīng)的氨基酸序列

8、。其中Csa5M464830.1基因在抗性親本K8上出現(xiàn)的差異更大，導(dǎo)致了基因后部大片段無法翻譯成氨基酸，致使蛋白重要的結(jié)構(gòu)域缺少，造成相應(yīng)蛋白功能的喪失。
　?。?）在黃瓜上克隆了擬南芥DMR6同源基因CsaDMR6-2的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。用15份遺傳背景和抗性不同的黃瓜材料克隆擬南芥DMR6的同源基因CsaDMR6-2，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，歐洲類型的抗病材料K15和K58的CsaDMR6-2的CDS序列在856