黃瓜抗霜霉病異源易位系選育、相關(guān)基礎(chǔ)研究及育種應(yīng)用.pdf

1、黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉病菌［Pseudoperonospora cubensis(Berk.& Curt.)Rostov］引起的，是世界范圍內(nèi)黃瓜主要葉部病害之一。由于黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，霜霉病抗性資源有限，至今國內(nèi)外育種者仍然不能很好地解決黃瓜霜霉病抗性問題。本文以含有霜霉病抗性基因酸黃瓜整套染色體組的遠緣雜交雙二倍體新種Cucumis hytivus為材料，與栽培黃瓜回交、自交，通過抗性篩選、形態(tài)學、細胞學和分子標記綜合鑒定，選育出

2、了黃瓜抗霜霉病原初異源易位系CT-01，對其高代自交系進行跟蹤鑒定，分析了其遺傳穩(wěn)定性。利用AFLP標記對易位系的系統(tǒng)演化進行了研究。設(shè)計特異引物，分離出了抗霜霉病相關(guān)基因cpc-l。以高代易位系CTO1R為親本配制組合，選育出了加工專用型新品種‘寧佳3號’。1.黃瓜異源易位系選育的相關(guān)技術(shù)和機理研究 研究了普通黃瓜根尖、組培芽體細胞染色體制片技術(shù)。通過采用合適的預(yù)處理藥劑，獲得了較長的根尖細胞中期染色體；在預(yù)處理方法上以低溫(0℃)

3、結(jié)合0.002mol·L<'-1> 8-羥基喹啉處理4-4.5h，和以2.5％混合酶液于25℃下解離4-4.5h可獲得較好的組胚芽染色體制片。 用改良的染色方法和染色體制片技術(shù)對普通黃瓜花粉母細胞(PMCs)減數(shù)分裂過程及雄配子體發(fā)育過程進行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，黃瓜減數(shù)分裂屬于同時型胞質(zhì)分裂，雙線期染色體具有明顯的交叉節(jié)并呈現(xiàn)出較易識別的棒狀或環(huán)狀形態(tài)，在末期I和末期Ⅱ有多核仁和核仁融合現(xiàn)象；雄配子體發(fā)育過程中觀察到兩核居中期

4、的特殊現(xiàn)象，在核居中期小孢子只有一層壁，而在核靠邊期小孢子出現(xiàn)了兩層壁；黃瓜的成熟花粉粒屬于兩核花粉粒。 在黃瓜高代自交系花粉母細胞減數(shù)分裂過程中，首次觀察到了微核仁現(xiàn)象。微核仁在PMCs中數(shù)目變化范圍在1-7之間。從細線期到四分孢子期都可觀察到微核仁，其數(shù)量和大小在分裂的不同時期有所差異，但在第一次和第二次減數(shù)分裂時期內(nèi)的變化趨勢相似。在微核仁的周期性變化過程中，染色體的行為正常，并沒有發(fā)現(xiàn)染色體畸變或染色體橋等現(xiàn)象。微核仁的發(fā)生不

5、受季節(jié)和栽培環(huán)境的影響。 利用上述有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體制片技術(shù)，對遠緣雜交原初二倍體雜種F<,1>和經(jīng)體細胞染色體自然加倍的雙二倍體新種Cucumis hytivus的細胞遺傳學進行了研究。結(jié)果表明，種間雜種F<,l>的PMCs減數(shù)分裂終變期和中期I有較多的二價體和多價體出現(xiàn)，其染色體平均構(gòu)型為：17.89I+0.3Ⅱ+O.13Ⅲ+0.03Ⅳ；新種的體細胞中后期姊妹染色單體有分離不同步的現(xiàn)象，PMCs減數(shù)分裂偶線期出現(xiàn)二價體部分

6、區(qū)段不聯(lián)會現(xiàn)象，粗線期同樣觀察到了部分區(qū)段二價體不配對現(xiàn)象，終變期和中期I具有明顯的拉十字和環(huán)狀四價體等多價體結(jié)構(gòu)。在中期I所觀察的60個PMCs中有26個細胞具有多價體 (占43.3％)， 此時期的染色體平均構(gòu)型為：0.75I+16.30Ⅱ+0.78Ⅲ+0.69Ⅳ+0.16V+0.025Ⅵ。以上結(jié)果表明黃瓜與酸黃瓜染色體組之間能夠發(fā)生廣泛的交換和重組，為下一步利用發(fā)生重組易位的配子選育異源易位系提供了可能。2．黃瓜-酸黃瓜抗霜霉病異

7、源易位系的選育、鑒定 根據(jù)上述染色體發(fā)生易位的機理，利用新種C．hytivus與普通黃瓜回交、自交，在對回交自交后代連續(xù)抗病性跟蹤鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合形態(tài)學、細胞學和RAPD分子標記輔助選擇，篩選出黃瓜抗霜霉病原初易位系CT-01。并對此材料的高代自交株系進行了抗病性、細胞學和AFLP分子標記鑒定，研究了其遺傳穩(wěn)定性。最后篩選出了CT-01的感病突變系CT01S和高代抗病易位系CT01R。 3．利用AFLP技術(shù)研究黃瓜異源

8、易位系的系統(tǒng)演化過程 以美洲型、歐洲型、華南型和華北型等典型黃瓜栽培品種為參照，采用AFLP分子標記技術(shù)對黃瓜．酸黃瓜異源易位系和其它漸滲系進行系統(tǒng)分類和系統(tǒng)演化研究。結(jié)果表明，在遺傳距離為0.135的位置，17份材料被分成六組。其中，二倍體雜種和原初易位系CT-01的親本HH<,l-8>為第4組，對于該組的劃分說明在易位初期形成了黃瓜亞屬的新類型；CT-01及其自交后代、其它漸滲系與北方型CC<,3>、CC<,4>為第6組。以

9、0.06為閥值，該組材料被分為3個亞組：高代易位系4201s和5211s(CT01R)為第1亞組；漸滲系5214s、5217s和5218s為第2亞組；原初易位系CT-01、漸滲系5215s和北方型黃瓜CC<,3.、CC<,4>為第3亞組。對于亞組的聚類結(jié)果表明了原初易位系CT-01和高代易位系CT01R雖然并入了北方類型大組，但在大組內(nèi)它們彼此間存在一定遺傳距離，各自獨立形成新的亞組。由此顯示出原初易位系在自交穩(wěn)定的過程中，可能由于外源

10、DNA與受體基因組間的相互作用使得高代易位系出現(xiàn)了一定程度上的遺傳和表觀遺傳變化，從而造成了亞組分類上的差異。 4．利用抗霜霉病異源易位系分離抗病相關(guān)基因 根據(jù)來源于野生種的特異核苷酸序列ch-365和已公布的甜瓜抗霜霉病的cDNA序列mp-19分別設(shè)計特異引物，對抗病易位系CT01R和感病突變系CT01S的gDNA和cDNA進行PCR擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物組合cdml-F和cdm2-R在CT01R的gDNA和cDNA中都特

11、異的擴增出了一條約430bp的特異條帶，而在CT01S中并未出現(xiàn)該條帶。對此特異條帶測序結(jié)果表明，此特異序列具有可通讀的氨基酸序列，在所編碼的130個氨基酸序列中，具有植物R基因NBS-LRR典型結(jié)構(gòu)域，由此證實此序列為抗病基因相關(guān)序列，并命名為cpc-1。通過NCBI網(wǎng)站blastx分析，發(fā)現(xiàn)此序列編碼的氨基酸序列與病原微生物入侵后產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵酶之一莽草酸脫氫酶(SKD)同源性較高，很可能具有類似SKD的活性。因此，進一步表明cpc

12、-1為異源易位系抗霜霉病基因相關(guān)序列。通過半定量RT-PCR擴增進行表達分析，表明cpc-1在接種后24h表達量即達到最大；在根、莖、葉三個器官里都存在，屬于組成型表達，表達量的大小順序為：葉>莖>根。5．利用異源易位系CT01R培育黃瓜加工型新品種‘寧佳3號’ 利用高代異源易位系CT01R與美國加工型血統(tǒng)的自交系7011A配制雜交組合，獲得加工型黃瓜新品種‘寧佳3號’。通過春季、秋季品種比較試驗，發(fā)現(xiàn)c寧佳3號’穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)，產(chǎn)