哈維弧菌Vh-TAA的基因克隆表達分析和粘附活性研究.pdf

1、上海海洋大學碩士學位論文碩士學位論文題目：目：哈維弧菌哈維弧菌VhTAA的基因克隆表達分析和粘附活性研究的基因克隆表達分析和粘附活性研究英文題目：英文題目：VhTAAGeneCloningExpressionAnalysisAdhesionActiveResearchinVibrioharveyi專業(yè)：業(yè)：臨床獸醫(yī)研究方向：研究方向：漁業(yè)生物病害姓名：名：劉金葉指導教師：指導教師：馮娟副研究員上海海洋大學，上海，200090中國水產(chǎn)科學

2、院南海水產(chǎn)研究所，廣州，510300學校代碼：10264研究生學號：M090104209上海海洋大學碩士學位論文I哈維弧菌哈維弧菌VhTAA的基因克隆表達分析和粘附活性研究的基因克隆表達分析和粘附活性研究摘要哈維弧菌（Vibrioharveyi）屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于海水環(huán)境中，是海水養(yǎng)殖動物的一種常見致病菌，可引起多種海水養(yǎng)殖動物發(fā)病，且死亡率高、影響范圍廣，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。病原菌的致病過程中粘附是引發(fā)宿主感染

3、的第一步，而粘附素作為病原菌一個重要毒力因子在細菌的粘附過程中起著重要的作用。隨著對病原菌致病機理研究的不斷深入，人們在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)了一類新的粘附素—三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素（TrimericAutotranspterAdhesions，TAA），這類廣泛存在于變形菌門，它們在氨基序列和序列大小上存在高度的差異，但是確具有相似的結(jié)構特征：即包含N末端信號肽、中間的承載結(jié)構域和C末端的轉(zhuǎn)運單位，其中他們的C末端的轉(zhuǎn)運單位在所有的TAA中是同

4、源的，并成為定義TAA的一個標志性區(qū)域。TAA作為革蘭氏陰性菌與宿主細胞相互作用的重要毒力因子，已成為當前研究病原菌致病機制的熱點。目前在哈維弧菌中還未見有關TAA的報道，我們通過同源比對后采用基因步移的方法成功獲得了哈維弧菌的一個636bp的開放閱讀框（F），該F編碼212個氨基酸，經(jīng)SMART軟件分析發(fā)現(xiàn)該氨基序列具有顯著的TAA的結(jié)構特征，采用信號肽序列分析軟件分析發(fā)現(xiàn)該氨基序列包含一個122aa的信號肽序列，對其預測的同源的C末

5、端的轉(zhuǎn)運區(qū)域進行二級機構比對分析，發(fā)現(xiàn)它們都包含4個β折疊和一個與其相連的Coiledcoil片段，最后經(jīng)daTAA驗證分析，證實獲得的序列為哈維弧菌的一個三聚體自轉(zhuǎn)運黏附素VhTAA。為了研究該蛋白的生物學功能，通過分析對預測的承載結(jié)構區(qū)域進行了原核表達，因為承載結(jié)構區(qū)域是TAA的功能區(qū)域。我們成功構建了重組表達質(zhì)粒pRSETAvhp，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)plysS，經(jīng)IPTG28C誘導表達，SDSPAGE蛋白電泳分